地龍提取物對百草枯誘導的肺纖維化模型小鼠炎癥因子的影響

陳宏，張偉，郭建波，宋倩男，王偉明

(1.黑龍江省中醫藥科學院，黑龍江 哈爾濱 150036；2.黑龍江中醫藥大學附屬第一醫院，黑龍江 哈爾濱 150040)

純品百草枯進入人體后，大部分可迅速被排泄到體外，但小部分經消化道吸收能夠讓患者中毒，并且對全身的器官產生影響,其中對肺和腎兩個器官影響最大，且在這兩個臟器中持續時間最長[1]。肺泡細胞(肺泡Ⅰ型細胞和Ⅱ型細胞)對百草枯具有主動攝取和蓄積特性，因此高濃度的百草枯會聚在肺和腎細胞中[2-3]，影響到臟器的功能運行，對其細胞破壞力強，從而導致肺和腎功能細胞壞死[4]。近期的藥理研究表明,地龍能夠解熱，并且對支氣管作用明顯，可以抗纖維蛋白原，相關研究表明，地龍能夠在一定程度上改變肺纖維化程度，特別是對于比較嚴重的患者，效果更明顯。本研究主要觀察和評價分析地龍提取物對百草枯(PQ)中毒模型小鼠肺纖維化的保護作用，并探討其對肺纖維化模型小鼠炎癥因子的影響，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

4周齡SPF級雄性小鼠60只，體質量18～20 g，由長春市億斯實驗動物技術有限責任公司提供。

1.2 藥品與試劑

逆轉錄試劑盒[北京天根(TIANGEN)技術有限公司]；PCR引物(北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成)；百草枯(PQ)(上海滬聯生物藥業有限公司，200 g/L)；維生素C注射液(天津金耀藥業有限公司，0.1 g/mL)；HE染色與Masson染色試劑盒(南京建成生物工程研究所)；TGF-β1、IL-6、IL-17酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒(美國R&D公司)。

1.3 小鼠肺纖維化模型的建立及藥物干預

40只小鼠隨機分為4組，每組各10只，包括正常對照組、模型組、地龍提取物組及維生素C 組(100 mg/kg)。正常對照組小鼠進行蒸餾水灌胃，其余各組均采用PQ液體(100 mg/kg)一次性灌胃造模。并對地龍提取物組及維生素C組進行相應給藥處理。

1.4 肺組織HE染色、Masson染色及評價

取小鼠右肺上葉，用4%中性甲醛固定，埋于石蠟中，切片，用HE和Masson染色。HE染色后肺組織按照Szapiel方法進行炎癥評分，肺組織切片或小鼠炎癥病理組。Masson染色后，膠原纖維的染色和綠面積百分比(綠染膠原面積/組織整體面積)的計算方法，在連續5個隨機讀取字段視覺軟件進行計算，作為肺纖維化程度的半定量參數。

1.5 RT-PCR法檢測

按照RT-PCR法檢測方法，對各組的樣本進行PCR試驗，從而得到各組的相關RT-PCR檢測結果，實驗過程嚴格按照說明書進行。

1.6 ELISA檢測TGF-β1、IL-6、IL-17 蛋白表達水平

按照ELISA 檢測方法，對各組的TGF-β1、IL-6、IL-17蛋白表達水平,嚴格按照試劑盒上說明書進行操作，并得到數據，進行計算，得出各組的蛋白表達水平。

1.7 統計學方法

2 結果

2.1 HE染色及炎癥評分

根據實驗結果表明，造模后第7天和第14天，模型組小鼠肺組織出現大量炎性細胞浸潤、肺泡間隔充血，炎癥評分較正常對照組升高(P<0.05)，而地龍提取物組小鼠肺組織炎癥評分較模型組和維生素C組降低(P<0.05)。見表1。

表1 各個時間點各組小鼠肺炎癥評分比較分)

2.2 Masson染色及纖維化程度分析

造模后第14天，地龍提取物組小鼠肺組織纖維化程度較模型組降低(P<0.05)。同時與正常對照組比較，模型組和維生素C組小鼠肺組織纖維化程度也同時存在一定的差異(P<0.05)。見表2。

表2 各個時間點各組小鼠肺纖維化程度比較

2.3 TGF-β1、IL-6、IL-17蛋白表達水平比較

模型組TGF-β1、IL-6及IL-17蛋白表達的變化與其mRNA水平基本一致。造模后第14天，地龍提取物組TGF-β1蛋白表達水平較模型組降低(P<0.05)。在造模后第7天和第14天，地龍提取物組IL-6蛋白表達水平低于模型組，造模后第7天和第14天，地龍提取物組的IL-17蛋白表達水平均較模型組降低(P<0.05)。見表3。

表3 各個時間點各組小鼠TGF-β1、IL-6、IL-17蛋白表達水平比較

3 討論

目前，肺纖維化的病因和發病機制尚不清楚，因此不可能進行有效的靶向治療[5-7]。臨床上以糖皮質激素和免疫抑制劑為基礎的治療方法占主導地位。肺部上皮細胞產生的白介素-8(Interleukin-8，IL-8)在肺纖維化中扮演了重要的角色[8]。另外相關文獻中指出細胞內活性氧族群(Reactive oxygen species，ROS)、氧化壓力和引發的下游信息傳遞在引發的肺部發炎中也非常重要，因此，若能有效減緩引起的肺部發炎和氧化壓力，則可能改善慢性阻塞性肺部疾病的情況[9-10]。引發肺纖維化的病因有許多，包含了過敏原、化學物質、輻射以及環境中的微粒。肺泡組織損傷、肺部發炎以及氧化壓力被認為是造成肺纖維化的主因[11]。肺纖維化的病程，是由于一連串的損傷、發炎和損傷位置的修復愈合過程中，單一或以上的步驟調節失控所導致的。在肺纖維化中一項主要現象為過多的促纖維化介質，如轉化生長因子-β1(Transforming growth factor-1，TGF-β1)促使纖維母細胞轉化成肌纖維母細胞，進而使膠原蛋白異常堆積[12-13]。

消除絡脈之瘀濁，保持絡脈氣血通暢和肺絡無損[14]，是治療肺纖維化及肺系絡脈病的關鍵。肺纖維化治療過程中，化學藥物的應用治療效果不甚理想。因此，中醫學的治療或許能為肺纖維化的治療提供新的選擇。雖然地龍對肺纖維化治療作用已有文獻報道，但是對其藥效研究尤其是在多種肺纖維化模型上的評價并沒有系統研究[15]，此外，其治療肺纖維化的分子機制也尚未被闡明，這一定程度上限制了該藥物的在肺纖維化治療上的應用。本研究結果顯示，造模后第7天和第14天，模型組小鼠肺組織出現大量炎性細胞浸潤、肺泡間隔充血，炎癥評分較正常對照組升高，而地龍提取物組小鼠肺組織炎癥評分較模型組和維生素C組降低。造模后第14天，地龍提取物組小鼠肺組織纖維化程度較模型組降低。模型組TGF-β1、IL-6及IL-17蛋白表達的變化與其mRNA水平基本一致。造模后第14天，地龍提取物組TGF-β1蛋白表達水平較模型組降低。在造模后第7天和第14天，地龍提取物組IL-6蛋白表達水平低于模型組，造模后第7天和第14天，地龍提取物組的IL-17蛋白表達水平均較模型組降低。因此，地龍提取物可通過抑制TGF-β1、IL-6和IL-17的表達來減輕PQ中毒造成的炎癥反應和肺纖維化。