食管鱗癌根治術患者組織中CD8+/FOXP3+比值及PD-L1表達與預后的相關性

張成偉，唱 寬，毛志剛，舒 建

(中國人民解放軍北部戰區空軍醫院心胸外科，遼寧 沈陽 110042)

由于環境污染、飲食習慣改變等多種因素，食管癌患病率攀升到惡性腫瘤第8位，不同的人種、地區食管癌類型有一定差別，在我國絕大部分患者為食管鱗癌(Esophageal squamous carcinoma，ESCC)[1,2]。與大多數惡性腫瘤相同，早期ESCC無明顯臨床癥狀，晚期患者5年生存率僅10%，臨床治療以手術為主，因此需要可預防ESCC轉移和復發的治療策略，進一步提高患者預后生存情況[3,4]。隨著人們對免疫系統的深入研究，發現了程序性死亡分子配體1(Programmed death ligand 1，PD-L1)與其受體(PD-1)組成的信號通路對免疫細胞有調控作用[5]。本研究檢測了免疫細胞CD8+/FOXP3+比值和PD-L1在ESCC組織中的表達情況，結合患者預后情況進行分析，現報告如下。

1 資料與方法

1.1臨床資料：將2014年1月至2019年1月我院行ESCC根治術患者的存檔蠟塊和癌旁正常組織(距病變部位>5cm處，且證實為無癌浸潤)石蠟標本各110例作為研究對象。癌與癌旁組織取樣于男性92例，女性18例；年齡43～86歲，平均(73.64±6.09)歲。

1.2納入及排除標準：納入標準：①均行ESCC根治術；②無放化療治療史；③經術后細胞學及組織學病理確診為ESCC，可以明確腫瘤大小、部位、浸潤程度。排除標準：①經CT、MRI等影像學診斷無法確定TNM分期；②合并其他惡性腫瘤；③已診斷為遠處轉移；④伴隨肺間質疾病或嚴重肝腎功能障礙；⑤患有血液系統疾病或傳染病等。

1.3免疫組化：切取4μm厚石蠟組織切片，行常規HE復染確認。經烤片、脫蠟、水化后，進行抗原熱修復、阻斷內源性過氧化物酶、封閉非特異性結合后，滴加一抗室溫下孵育。TBST沖洗后滴加新鮮配制的DAB顯色，2～3min后用自來水沖洗終止顯色，蘇木素復染，封固后于顯微鏡下觀察。已知的PD-L1、CD8+、FOXP3+陽性標本為陽性對照。觀察高倍(×400)視野下陽性細胞百分數及染色強度(見圖1)，陽性細胞占比≤5%為0分、占比為6%～25%計1分、占比26%～50%計2分、占比51%～75%計3分、占比≥76%計4分；細胞未染色計0分、淡黃色為1分、棕黃為2分、棕褐為3分，總分=細胞染色評分×細胞占比評分，總分≥3分即為陽性表達。結果評判由2人進行雙盲讀片確定。

圖1 ①ESCC組織中PD-L1陽性表達；②ESCC組織中FOXP3+陽性表達，細胞核染色；③ESCC組織中CD8+陽性表達，細胞膜染色

1.4觀察指標：①比較CD8+/FOXP3+、PD-L1在ESCC組織和癌旁正常組織中的陽性表達；②收集110例ESCC患者臨床資料，分析年齡、性別、腫瘤部位、TNM分期、浸潤、分化程度與CD8+/FOXP3+、PD-L1陽性表達的關系；③對110例ESCC根治術患者通過電話或門診的形式隨訪，末次隨訪時間為2020年1月，統計患者生存情況，分析CD8+/FOXP3+、PD-L1表達與1年生存率的關系，無失訪患者。

2 結 果

2.1CD8+/FOXP3+比值、PD-L1在ESCC組織和癌旁正常組織中的表達：CD8+/FOXP3+在ESCC組織中的陽性表達率低于癌旁組織，PD-L1在ESCC組織中的陽性表達率高于癌旁組織(P<0.05)，見表1。

表1 ECD8+/FOXP3+ PD-L1在ESCC組織和癌旁正常組織中的表達

2.2CD8+/FOXP3+比值、PD-L1與ESCC臨床病理參數間的關系：不同TNM分期、淋巴結轉移情況、浸潤程度、腫瘤直徑和分化程度的ESCC組織中CD8+/FOXP3+、PD-L1的陽性表達率比較，差異有統計學意義(P<0.05)；但不同年齡、性別的ESCC組織中CD8+/FOXP3+比值、PD-L1 CD8+/FOXP3+表達率比較，差異無統計學意義(P>0.05)，見表2。

表2 CD8+/FOXP3+比值 PD-L1與ESCC臨床病理參數間的關系

2.3影響ESCC患者預后生存的單因素分析：110例行ESCC根治術患者1年總生存率為86.36%(95/110)，單因素分析顯示，TNM分期T1～2期的患者1年生存率為高于T3期患者；合并淋巴結轉移患者1年生存率低于未合并淋巴結轉移患者；PD-L1陽性表達組患者1年生存率低于陰性表達組患者；CD8+/FOXP3+陽性表達組患者1年生存率高于陰性表達組患者，差異均有統計學意義(P<0.05)，不同年齡、性別、浸潤程度、腫瘤直徑的ESCC根治術患者生存率比較無差異(P>0.05)，見表3。

表3 影響ESCC患者預后生存的單因素分析

2.4影響ESCC患者預后生存的多因素分析：以ESCC患者術后1年生存情況為因變量，以上述有統計學意義項(TNM分期、淋巴結轉移、PD-L1、CD8+/FOXP3+)作為自變量，對上述因素進行賦值，(TNM分期：T1～2期=1、T3期=0；淋巴結轉移：無=1、有=0；PD-L1：陰性=1、陽性=0；CD8+/FOXP3+：陽性=1、陰性=0)，并將其納入Logisitic回歸模型中，發現TNM T3期分期、合并淋巴結轉移、PD-L1陽性表達、CD8+/FOXP3+陰性表達是ESCC患者預后的獨立影響因素(P<0.05)，見表4。

表4 影響ESCC患者預后生存的多因素分析

3 討 論

近年來環境污染加劇，人們飲食習慣改變，食管癌患病率逐年攀升，在我國絕大部分患者表現為ESCC，早期ESCC無明顯臨床癥狀，晚期患者5年生存率僅10%。ESCC的發病率逐年升高，根治性手術和術后輔助化療是目前的主要治療手段，ESCC因部位特殊性、腫瘤大小、分化程度等指標會影響根治性手術切除的效果和預后情況[6]。目前對行ESCC根治術患者預后的預測主要通過檢測血清腫瘤標志物水平和明確TNM分期，但二者對ESCC患者預后的判斷準確度較低[7]。因此，繼續尋找新的生物學標志物對提高患者的術后治療效果顯得尤為必要。

PD-1/PD-L1通路在惡性腫瘤的發展中有負向調節作用，PD-L1作為一種跨膜蛋白，對免疫細胞有一定活化作用，可以幫助腫瘤細胞逃避免疫系統淋巴細胞的進攻，關嵩[8]等研究指出經免疫組化檢測發現PD-L1在ESCC患者組織中的陽性表達率與性別、腫瘤分期、分化程度相關。又有研究指出PD-L1在ESCC組織中的陽性表達率遠高于正常組織[9]。CD8+對腫瘤細胞的殺傷力在多項研究中被證實，通過分泌穿孔素和淋巴毒素等多種方式殺死腫瘤細胞；而FOXP3+基因突變會引發自身免疫缺陷疾病，阻礙淋巴細胞的調節功能；所以CD8+/FOXP3+比值的表達情況與自身免疫系統的功能相關，CD8+/FOXP3+表達越高，免疫系統在抗腫瘤過程中發揮的效用越高[10]。高翔[11]等的研究提示術前血清中性粒淋巴細胞比值與患者預后密切相關。本研究中，ESCC的TNM分期、淋巴結轉移情況和浸潤程度影響CD8+/FOXP3+和PD-L1的表達情況，腫瘤的直徑、分化程度影響PD-L1表達，說明PD-L1和CD8+/FOXP3+的表達與多項臨床病理參數都有關系，可能對患者的預后有影響。

本研究對比了患者預后生存情況，110例行ESCC根治術患者1年總生存率為86.36%(95/110)，單因素分析顯示PD-L1陽性表達患者1年生存率低于陰性表達患者；CD8+/FOXP3+陽性表達患者1年生存率高于陰性表達患者，提示PD-L1陰性表達與CD8+/FOXP3+陽性表達對患者預后有正向影響，這與PD-L1激活后幫助腫瘤細胞進一步發展、FOXP3+陰性表達影響免疫系統的正常運作、CD8+陽性表達利于溶解腫瘤細胞的功能相關。多因素分析結果顯示，TNM T3期分期、合并淋巴結轉移、PD-L1陽性表達、CD8+/FOXP3+陰性表達是影響ESCC患者預后的獨立危險因素，提示CD8+/FOXP3+陽性表達、PD-L1陰性表達、TNM分期為T3期、有淋巴結轉移的行ESCC根治術的患者可能出現不良預后，應在臨床治療中重點觀察。本研究亦存在不足之處，回顧性研究選例存在偏倚，有待日后擴大樣本進行前瞻性研究，驗證CD8+/FOXP3+、PD-L1在ESCC患者體內的表達與其預后生存的關系。

綜上所述，CD8+/FOXP3+陽性表達、PD-L1陰性表達、TNM分期為T3期、有淋巴結轉移是影響ESCC根治術后患者預后的獨立危險因素，可以為今后免疫治療藥物、患者術后治療提供一定參考。