Taqman探針RT-qPCR法檢測柑橘黃龍病與海南柑橘主產區黃龍病現狀

李 歡， 康秀晗， 李德飛， 陳惠查， 黃家權

(1.貴州省農業科學院 農作物品種資源研究所， 貴州 貴陽 550006； 2.海南省眾邑新材料研究院有限公司， 海南 三亞 572025； 3.海南大學 熱帶作物學院海南省熱帶生物可持續利用重點實驗室， 海南 海口 570228； 4.貴州省威寧自治縣黑石頭鎮第二小學， 貴州 威寧 553105)

柑橘黃龍病(HLB)又叫青果病，是世界柑橘生產中毀滅性的病害之一，有柑橘“癌癥”之稱，感病果園通常在5～8年內就會全園覆滅，目前該病已在全球超過40多個國家和地區流行[1]。黃龍病的病原物是一種難以培養的韌皮部桿菌屬革蘭氏陰性菌[2]，目前已知的黃龍病菌有亞洲種(CandidatusLiberibacter asiaticus，Las)、非洲種(Ca. L. africanus, Laf)和美洲種(Ca. L. americanus, Lam)3個種[3]，其中Las分布最廣，也是我國柑橘黃龍病發生的致病種[4]。柑橘黃龍病主要通過帶病接穗嫁接和柑橘木虱交叉取食傳播[5]，其中Las和Lam主要通過亞洲柑橘木虱(Diaphorinacitri)、Laf主要通過非洲柑橘木虱(Triozaerytreae)傳播[6]。目前對柑橘黃龍病的病原菌雖已有統一的認識，但由于黃龍病菌尚未實現體外人工培養，對其生物學特性知之甚少，導致抗病品種和有效藥劑缺乏，對柑橘黃龍病的控制僅限于預防水平。同時，柑橘黃龍病典型癥狀包括果實出現“紅鼻子果”[7]、葉片均勻或斑駁黃化[1]等，這與一些缺鋅、缺鎂等缺素癥，以及病毒病危害癥狀相似，因此，黃龍病癥狀診斷具有較大的主觀性。建立快速、有效、準確的分子檢測和診斷方法，有助于及早清除病原，防止黃龍病擴散蔓延。同時，研究黃龍病菌在不同自然氣候條件下寄主植物體內的分布和含量水平，有助于加深對其生物學特性及其在寄主植物體內擴散定殖特性和致病機理的研究。

由于病原菌在宿主植株內的低含量、不均勻分布等，使得傳統的PCR方法對黃龍病菌在宿主植株或者昆蟲體內的持續檢測無論是在準確性還是靈敏性等方面都存在缺陷[8-9]。LI等[10]的研究表明：利用Taqman探針的實時熒光定量PCR(Real-time fluorescence quantitative polymerase chain reaction，qPCR)技術檢測黃龍病菌與傳統PCR相比，具有高靈敏度、特異性、準確性和穩定性，高重復率和低污染等優點，且RT-qPCR可對DNA進行定性定量的檢測和分析，因此該方法是研究確診與檢測黃龍病菌在宿主植株體內含量和分布的有效手段。TEIXEIRA等[11]在圣保羅州和巴西兩地對甜橙葉片進行黃龍病美洲種(Lam)的檢測后發現，其在葉片中分布不均，在無癥狀的葉片中未檢測出黃龍病菌，而在斑駁型黃化癥狀的葉片中檢測出較高濃度的黃龍病菌，中脈組織中平均含量達到107個/g。TATINENI等[12]發現感病柑橘根、皮、葉、花、果實中均含有黃龍病菌，而在種子胚胎和胚乳中未能發現。LI等[13]研究發現黃龍病菌可以感染柑橘植株多個組織，且在不同組織中含量差異巨大，地上部組織中平均含量達1010個/g，病菌含量從接種位點向上下兩側逐漸蔓延增多。

我國南方地區柑橘黃龍病發生嚴重，隨著海南省柑橘種植面積的不斷擴大，面臨的潛在威脅也越來越大。針對海南省柑橘黃龍病的發生狀況，筆者參考LI等[10]的方法，以植物細胞色素氧化酶(COX)引物探針組(COXfpr)為內參，用黃龍病特異的引物探針組(HLBaspr)對海南省不同品種、不同組織部位的Las進行實時熒光定量檢測分析，以期建立一種不依賴于癥狀的高準確性HLB分子診斷方法，了解海南省柑橘黃龍病的整體分布概況，供研究黃龍病菌在柑橘體內發生發展規律參考。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

2018年4—5月對海南省臨高縣新盈農場的5年生紅肉蜜柚、澄邁縣福山果園的10年生紅江橙各選4株疑似黃龍病株，每株按新葉、老葉、新梢、莖稈、次級根、主根等分部位取樣，其中葉片按顯癥(斑駁黃化型)和不顯癥(表型正常)分類采集；對瓊中縣、屯昌縣、儋州市的柑橘園各選4株疑似黃龍病株的顯癥或不顯癥葉片取樣，并以瓊中縣苗圃基地種植于溫室大棚的紅江橙作陰性對照。

1.2 樣品總DNA提取

用清水將植株組織沖洗干凈，分別稱取200 mg(葉片取中脈，新梢、莖稈取表皮)。采用TIANGEN公司生產的新型植物基因組DNA提取試劑盒(DNAsecure Plant Kit，DP320)提取各組織樣品的DNA，懸浮于150 μL TE洗脫緩沖液中，-20℃保存待用。用Nanodrop 2000-超微量分光光度計測定提取的DNA濃度。

1.3 RT-qPCR檢測病原菌

qPCR參照LI等[10]的方法并稍作修改。黃龍病引物為HLBas/HLBr，探針為HLBp；內參基因引物為COXf/COXr，探針為COXp。反應體系為20 μL: 2×Premix Ex Taq(Probe qPCR) : 10 μL，250 nM黃龍病引物HLBas/HLBr:各0.5 μL，150 nM探針HLBp:0.3 μL，300 nM內參引物COXf/COXr:各0.3 μL，150 nM內參探針:0.3 μL，DNA模板:5 μL。擴增程序為：95℃變性20 s，然后95℃ 1 s，58℃ 40 s，共50個循環。每個DNA樣品重復測定3次，每次測定均帶1個空白對照、陽性對照和陰性對照。使用德國QIAGEN生產的Rotor-Gene Q儀器進行Rt-qPCR，各引物和探針均由上海生工生物股份有限公司合成，qPCR試劑購自日本TaKaRa公司。

1.4 Las濃度計算

采用LI等[14]的廣譜線性回歸方程：Y=13.82-0.286 6X對Las進行定量分析。其中Y代表DNA模板濃度的Lg值，X代表RT-qPCR后的熒光閾值(CT值)，由于qPCR中5 μL的DNA模板是從200 mg植株組織中提取的并懸浮于150 μL TE洗脫緩沖液中，且基于Las 16S rDNA設計的序列中，每個病原菌細胞中含有2份靶DNA，故最終Las的濃度為10Y×150×5/2(個/g)。

1.5 數據分析

采用Excel 2007和SPSS 20.0軟件進行統計分析，應用Duncan法進行差異顯著性檢驗。

2 結果與分析

2.1 RT-qPCR檢測Las

對感染了Las的臨高紅肉蜜柚樣品DNA進行10倍的連續濃度梯度100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6稀釋(表1)后進行qPCR。檢測結果表明：HLBaspr引物探針組在DNA稀釋到10-5時，每5 μL DNA中仍能檢測到Las(圖1)，而稀釋到10-6時則收集不到熒光信號。因此，使用HLBaspr引物探針組對黃龍病的檢測下限為10-5稀釋度，相當于每67 ng新鮮葉片中脈組織中含有一個靶DNA(200 mg÷150 μL×10-5×5 μL)，即Las在葉中脈組織的含量約1.49×107份DNA/g。

表1 實時熒光定量PCR(Taqman)的靈敏度檢測

2.2 Las在紅肉蜜柚和紅江橙各部位中的含量

對臨高縣的紅肉蜜柚和澄邁縣的紅江橙2品種各3株疑似黃龍病感病植株按主根、次級根、莖、新梢、老葉、新葉6個部位取樣進行qPCR。檢測結果(表2)表明：紅肉蜜柚和紅江橙植株各部位均可檢測出Las病原菌，且各部位Las的含量差異較大。紅肉蜜柚各部位Las的含量從次級根、老葉、主根、新葉、莖、新梢依次降低，差異水平在4個數量級內變化(圖2)，變化范圍從1×107個/g～3×1011個/g，其中次級根含量達2.31×1011個/g，新梢含量為1.15×107個/g；紅江橙各部位Las含量從新葉、老葉、新梢、莖、次級根、主根依次降低，差異水平在3個數量級內變化，變化范圍從1×109個/g～4×1011個/g，其中新葉含量達3.65×1011個/g，主根含量為1.51×109個/g。從整體結果看，紅肉蜜柚各部位COXfpr的CT值較穩定且正常，而紅江橙主根和次級根COXfpr的CT值偏高，這可能與感病植株部分根死亡，DNA被降解，致檢測條件下的基因組DNA的濃度相對較低有關。

表2 RT-qPCR 定量檢測紅肉蜜柚和紅江橙不同組織中黃龍病菌的循環閾值及其含量

2.3 黃龍病顯癥與不顯癥葉片中Las的含量

對采自臨高縣的紅肉蜜柚和澄邁縣的紅江橙2個品種的斑駁黃化型與表型正常的老葉、新葉中脈進行qPCR檢測結果表明(圖3)：2個品種的新葉和老葉中脈均能檢測出Las，且斑駁黃化型葉片Las含量高于表型正常葉片，含量差異在老葉中表現得尤為突出，斑駁黃化型較表型正常老葉高出104～106倍，新葉則僅高出10～100倍。紅江橙新葉Las含量高于紅肉蜜柚，老葉中二者含量相差不大。

2.4 海南省柑橘黃龍病的qPCR檢測

采用Taqman探針RT-qPCR法對海南省瓊中縣、澄邁縣、屯昌縣、臨高縣、儋州市等柑橘主產區主栽的紅肉蜜柚、水晶蜜柚、甜橙、福橙、檸檬等品種的疑似黃龍病樣品進行檢測的結果表明(表3)：在主產區采集的23個疑似黃龍病樣品DNA樣品中，只有來自儋州市的其中1份水晶蜜柚樣品檢測呈陰性，其余的樣品中均檢測出了黃龍病菌，Ct值介于16～31.78。說明海南省柑橘主栽區均受到了不同程度的黃龍病菌危害。

表3 RT-qPCR對海南省柑橘黃龍病疑似樣品檢測循環閾值

3 結論與討論

1) 本研究應用Taqman探針qPCR法在海南省感病紅肉蜜柚和紅江橙的主根、次級根、莖、新梢、老葉、新葉等6個組織中都檢測出Las，且Las在各組織或同一組織不同品種間的含量差異較大，與TATINENI等[12]、LI等[13]、婁兵海等[15]研究的分布、定殖特性一致。LI[13]的研究表明Las的含量在103范圍內波動，不同組織中平均含量介于7×108～2×1011個/g，而本研究發現Las在不同組織中含量差異顯著，平均含量在104個/g范圍內波動，介于1×107～3×1011個/g，且紅肉蜜柚中次級根的Las含量最高，紅江橙新葉中脈的Las含量最高，原因可能是由于柑橘品種以及所處發病時期不同引起的差異。TEIXEIRA等[11]對斑駁黃化型和表型正常型葉片進行了Lam的檢測，發現在不同顯癥葉片中黃龍病菌分布差異巨大，且斑駁黃化型葉片含量較高，與本研究結果相一致。但TEIXEIRA等[11]的研究僅在斑駁黃化型葉片中檢測到Lam，而在無癥狀葉片中并未檢測出，本研究在紅肉蜜柚和紅江橙2個品種的斑駁黃化型和表型正常型的新葉和老葉中均檢測出了Las，且斑駁黃化型葉片Las含量均高于表型正常葉片，該結果的差異可能是試驗品種、取樣時間和檢測方法不同導致。

2) 黃龍病葉片是否斑駁黃化和有“紅鼻子”果出現，通常是田間快速診斷的依據，但LOPES等[16]研究認為，斑駁黃化癥狀在高溫時會消退而影響診斷。LI等[10]、胡浩等[17]研究表明，Taqman探針法較傳統的PCR和SYBR Green I熒光染料法有更高的靈敏度、特異性和準確性，本研究采用Taqman探針法檢測Las的極限為10-5稀釋度，與LI等[10]的結果一致，而與胡浩等[17]的檢測極限10-8稀釋度存在差異，可能是因品種差異造成。

3) 關于Las的濃度計算，采用LI等[14]證明的對不同地區、不同柑橘品種和不同組織部位都適用的廣譜線性回歸方程進行定量。ZHANG等[18]研究認為，使用該定量方法，當CT值大于36.0時，即視為檢測結果為陰性。本次檢測中僅1份樣品(儋州水晶蜜柚CT= 38.55)CT值大于36.0，即檢測結果為陰性，可認為該樣品尚未感染黃龍病菌。

4) 海南省是優良柑橘種植區，柑橘產業是拉動地方經濟發展不可或缺的產業，因此對柑橘黃龍病這種毀滅性病害進行檢測，為預防該病流行有深遠意義。檢測發現Las已在海南各柑橘產區出現，且情況嚴重。本研究使用的Taqman探針RT-qPCR法可快速、精準的檢測海南省柑橘Las，可作為一種穩定可靠的檢驗檢疫技術推廣應用。