瀘定縣主產區油菜核酸檢測分析

李 憶

(1.四川民族學院 農學院， 四川 康定 626001； 2.川藏滇青林草撫育和利用研究中心, 四川 康定 626001)

油菜是我國重要的油料作物之一，對油菜的改良有傳統育種和現代分子生物學育種改良2種方法。利用現代分子生物學技術，將某些生物的特定基因轉移到油菜中去，使其出現油菜不具有的農藝性狀或產物，此類統稱為轉基因油菜，轉基因油菜可抗除草劑、抗病蟲害等。而以轉基因作物作為原料進行生產、加工得到的食品被稱為轉基因作物食品[1]。隨著基因工程研究不斷發展，許多轉基因植物如抗病毒木瓜、棉花等開始大面積種植、銷售。由于轉基因作物不是自然產物，安全風險存在爭論，并且受到了各國政府的高度重視，并要求對不符合自己規定閾值的產品進行標識[2]。我國對轉基因技術管理嚴格，產品中含有某種轉基因成分必須標識[3]。我國政府相關職能部門每年對省市縣作物產品進行不定期抽查監督，但由于目前轉基因檢測尚處于起步階段，很多檢測機構、設施及相關配套資金不足，使得檢測范圍、區域有限。筆者選擇甘孜州瀘定縣區域內售賣油菜種子或者種植油菜籽粒作為抽取對象，隨機抽取瀘定縣農資市場售賣的油菜種子樣品6份，種植油菜成熟籽粒樣品12份，采用相關國家或行業標準對樣品進行了定性PCR核酸檢測分析，以期為該縣售賣和種植油菜的轉基因檢測調查提供數據，并為政府制定相關轉基因食品安全政策提供科學依據。

1 材料與方法

1.1 材料

油菜轉基因材料購自歐盟標準物質和計量研究所(IRRM)，待測樣品均為隨機抽取甘孜州瀘定縣油菜主產區內售賣的油菜種子或種植的油菜籽粒。

1.2 主要試劑

PCR擴增引物由成都擎科梓熙生物技術有限公司合成；植物基因組提取試劑盒、Master Mix、標準分子量(M)購于成都博瑞克生物技術有限公司；CTAB、SDS等生化試劑均為國產分析純。

1.3 核酸抽提

樣品核酸抽提按照植物基因組提取試劑盒方法進行[4]。

1.4 PCR檢測

1.4.1 基因及引物 根據轉基因油菜調控元件選擇油菜中常用的外源基因花椰菜花葉病毒啟動子(P-CaMV 35S)、玄參花葉病毒啟動子(P-FMV 35S)、花椰菜花葉病毒終止子(T-CaMV 35S)和豌豆的核酮糖-1,5二磷酸羧化酶E9基因小亞基3′端序列終止子(T-E9 3′)4個基因作為篩查檢測基因，特異性引物序列引用國家、行業相關標準或自設序列(表1)。將各檢測基因上下游引物濃度稀釋為10 μmol/L。

表1 引物序列、擴增片段長度及檢測依據

1.4.2 PCR產物 反應體系東洋紡2×Master Mix 10 μL，上下游引物F、R各0.8 μL，樣品DNA模板1.5 μL，加雙蒸水至20 μL。擴增程序：95℃預變性3 min；94℃變性20 s、58℃退火20 s、72℃延伸30 s，35個循環；72℃保持3 min，4℃保存。

1.5 電泳峰值

PCR反應結束后，核酸通過超微量分光光度計測定濃度，并將其濃度稀釋至25 ng/μL，經過定性PCR反應擴增，擴增產物經過Qiagen QIAxcel Advanced毛細管電泳儀進行分離分析，獲得外源基因的電泳峰值典型圖譜。

2 結果與分析

由表2和圖1～5外源基因的電泳峰值典型圖譜可見，18份油菜樣品未檢測到油菜外源基因P-FMV 35S(172 bp)、P-CaMV 35S(195 bp)、T-CaMV 35S(134 bp)、T-E9 3′(265 bp)。

表2 樣品信息及外源基因

3 結論與討論

分析樣品為種子或籽粒，總DNA提取純化均相對容易且含量豐富，樣品的選定為核酸分析工作奠定了良好的基礎。為了提高轉基因檢測的分析效果，研究采用分辨率更高、峰圖更直觀、清晰的毛細管電泳引入到PCR檢測體系中。目前毛細管電泳技術已廣泛應用于無機及有機化合物、蛋白質、氨基酸、肽、核酸的分離分析等方面[6-7]。通過典型圖譜可以看到毛細管電泳的峰形圖好，有利于分析研究，此分析方法分辨率可達2～3個堿基，但由于分辨率太高，校準條帶的微小偏差將導致有的目標峰與實際峰偏差1～2個堿基，均屬于誤差范圍內，可認為是同一物質，如需進一步判斷物質的準確性可通過核酸序列分析。

2018年是生物技術/轉基因作物商業化的第23年，據農業生物技術應用國際服務組織(ISAAA)統計全球共26個國家1 700萬名農民種植了1.917億hm2的轉基因作物，油菜種植面積占1 010萬hm2[8]。試驗選擇檢測對象時，也正是考慮到了當前瀘定縣涉及種植面積較大的經濟作物，所以選擇了油菜作為檢測分析對象。試驗結果表明，瀘定區域內所售賣或種植的油菜未檢測到P-FMV 35S、P-CaMV 35S、T-CaMV 35S、T-E9 3′等外源轉基因成分，說明相關職能部門做的宣傳監督工作到位以及種植者合法種植。但由于研究采取隨機抽樣獲得油菜樣品，測試樣品中未檢測到相關外源轉基因成分，這并不能說明該區域內售賣或種植的油菜中不含這些外源基因的油菜品種。因此仍需相關職能部門加強監管，重視農產品的來源，定期對市場中的農產品進行抽檢，為消費者提供消費選擇，保護消費者的合法權益。