基于GC-MS與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的青皮揮發(fā)油防治阿爾茨海默癥的活性成分及作用機(jī)制研究

王騰華 羅穎懿 王馭辰 任之堯 唐建新 李詠梅 方翼 吳波

摘 要 目的：預(yù)測(cè)青皮揮發(fā)油防治阿爾茨海默病（AD）的主要活性成分和潛在作用靶點(diǎn)。方法：采用氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）分析青皮揮發(fā)油化學(xué)成分，并借助NIST 11.L數(shù)據(jù)庫(kù)和人工數(shù)據(jù)解析進(jìn)行成分的結(jié)構(gòu)鑒定。借助中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP）、PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)等預(yù)測(cè)青皮揮發(fā)油活性成分及其對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)，借助GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)等挖掘AD相關(guān)靶點(diǎn);利用Venny 2.1.0軟件映射以獲取青皮揮發(fā)油防治AD的直接靶點(diǎn);借助STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytoscape 7.2.1軟件挖掘核心節(jié)點(diǎn)，利用Venny 2.1.0軟件映射并去重后獲取青皮揮發(fā)油防治AD的間接靶點(diǎn);借助DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(kù)對(duì)上述直接和間接靶點(diǎn)（即作用靶點(diǎn)）進(jìn)行基因本體（GO）功能富集和KEGG通路富集分析;采用Cytoscape 7.2.1軟件，以節(jié)點(diǎn)度值、介數(shù)中心度、緊密中心度為指標(biāo)，對(duì)青皮揮發(fā)油“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，挖掘關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)。結(jié)果與結(jié)論：GC-MS法共分離并鑒定出青皮揮發(fā)油化學(xué)成分40個(gè)，均為活性成分，包括右旋檸檬烯、γ-萜品烯等。共挖掘出活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)151個(gè)、AD相關(guān)靶點(diǎn)1 291個(gè)，其中直接靶點(diǎn)48個(gè)、間接靶點(diǎn)41個(gè)。上述89個(gè)作用靶點(diǎn)主要富集于細(xì)胞分?jǐn)?shù)、軸突、胞漿等細(xì)胞組分，細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)、對(duì)有機(jī)物的反應(yīng)等生物過(guò)程，蛋白激酶活性、胺受體活性等分子功能，以及癌癥通路、鈣信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路等信號(hào)通路（P<0.05）。共挖掘出α-萜品烯、β-elemen、百里酚、（-）-4-萜品醇等關(guān)鍵成分10個(gè)，雄激素受體（AR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶14、毒蕈堿乙酰膽堿受體M1等關(guān)鍵靶點(diǎn)21個(gè)，表明青皮揮發(fā)油防治AD呈多成分、多靶點(diǎn)、多通路的作用特點(diǎn)。

關(guān)鍵詞 青皮;揮發(fā)油;氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù);網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué);阿爾茨海默病;機(jī)制

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To predict the active components and potential target of volatile oil of Citri reticulatae preventing and treating Alzheimers disease （AD）. METHODS： The volatile oil of C. reticulatae was determined by GC-MS， and identified according to NIST 11.L database and manual data analysis. The active components and targets of volatile oil of C. reticulatae were predicted through TCMSP and PharmMapper database. The related targets of AD were obtained by using GeneCards and OMIM databases. Venny 2.1.0 software mapping was used to obtain the direct targets of volatile oil of C. reticulatae against AD. Core nodes were mined with STRING database and Cytoscape 7.2.1 software， and? the indirect targets of volatile oil of C. reticulatae against AD were obtained by mapping and duplication coith Venny 2.1.0 software. With the help of DAVID 6.7 database， the above direct and indirect targets （i.e. action targets） were used for gene ontology （GO） function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis. Using Cytoscape 7.2.1 software， topology analysis was conducted for the network of “active components-acting targets” of volatile oil of C. reticulatae， with node degree value， betweenness centrality and closeness centrality as indexes， then key components and key targets were mined. RESULTS & CONCLUSIONS： A total of 40 chemical components in volatile oil were identified by GC-MS， all of them were active components， including D-limonene， γ-terpinene， etc. A total of 151 active components-corresponding targets and 1 291 AD-related targets were mined， including 48 direct targets and 41 indirect targets. The above 89 targets were mainly concentrated in cell fraction， axon， cytosol and other cell components; intracellular signaling cascade， response to organic substance and other biological processes; protein kinase activity and amine receptor activity and other molecular functions; as well as cancer pathway， calcium signaling pathway and neurotrophin signaling pathway （P<0.05）. A total of 10 key components including α-terpinene， β-elemen， thymol and （-）-4-terpineol， as well as 21 key targets such as androgen receptor， prostaglandin G/H synthase 2， mitogen activated protein kinase 14， muscarinic acetylcholine receptor M1 were excavated， indicating the effect of volatile oil of C. reticulatae against AD had the characteristics of multi-component， multi-target and multi-channel.

KEYWORDS? ?Citri reticulatae; Volatile oil; GC-MS; Network pharmacology; Alzheimers disease; Mechanism

青皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實(shí)的果皮。其中，5～6月收集自落的幼果曬干者，習(xí)稱(chēng)“個(gè)青皮”;7～8月采收未成熟的果實(shí)，在果皮上縱剖成四瓣至基部，除盡瓜瓣后曬干者，習(xí)稱(chēng)“四花青皮”[1]。除橘類(lèi)未成熟果實(shí)的果皮外，其同屬植物甜橙[C. sinensis（Linn.）Osbeck]、枸櫞（C. medica L.）以及茶枝柑（C. reticulata Blanco cv. Chachiensis）等柑類(lèi)未成熟果實(shí)的果皮在有的地區(qū)亦作青皮使用[2]。青皮味辛、苦，性微溫，沉降下行，偏于疏肝膽氣分，有破氣行痰、消積化滯之功效[3]，對(duì)心腦血管、消化系統(tǒng)、呼吸系統(tǒng)[4]及平滑肌[5]均具有廣泛的藥理作用，主要用于治療肝氣郁滯、疝氣、胸脅胃脘疼痛、食積、乳房脹痛、脘悶噯氣、久瘧癖塊等癥[6-7]。青皮揮發(fā)油為其主要藥效成分之一，具有理氣、調(diào)氣和抗菌等活性[8-10]。其中，D-檸檬烯是青皮發(fā)揮理氣作用的主要有效成分，同時(shí)還兼具祛痰、抗腫瘤[11-14]和廣譜抗菌[15]等作用;對(duì)傘花烴、芳樟醇、α-萜品醇以及檸檬醛等是青皮發(fā)揮調(diào)氣作用的主要成分[4]，且α-萜品醇還具有顯著的抗菌作用[16]。

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一種中樞神經(jīng)退行性疾病，也是老年癡呆中較常見(jiàn)的類(lèi)型之一。現(xiàn)有治療藥物的效果欠佳[17]，其中常用的乙酰膽堿酯酶抑制劑等化學(xué)藥物作用靶點(diǎn)單一，且長(zhǎng)期服用會(huì)引發(fā)副作用和成癮性[18]。因此，多靶點(diǎn)抗AD研究已成為相關(guān)藥物研發(fā)的熱門(mén)方向[19]。中藥具有豐富的藥理活性，可通過(guò)多通路、多靶點(diǎn)發(fā)揮治療作用[4]。中藥揮發(fā)油是中藥材中一種具有揮發(fā)性的油狀液體，易透過(guò)血腦屏障并迅速入腦，具有藥理活性豐富、起效靶點(diǎn)多、不良反應(yīng)較少且癥狀輕微等特點(diǎn);同時(shí)，其獨(dú)特的芳香氣味容易讓患者接受并在治療過(guò)程中產(chǎn)生愉悅感[18]。可見(jiàn)，中藥揮發(fā)油在防治AD領(lǐng)域中可能具有較大潛力。已有研究顯示，羅勒揮發(fā)油可抗抑郁[20]，石菖蒲揮發(fā)油可抗焦慮[21]，辛夷、溫郁金揮發(fā)油可改善實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的學(xué)習(xí)記憶能力[22-23]，當(dāng)歸揮發(fā)油可提高記憶力、防治AD[24]等。有關(guān)青皮揮發(fā)油防治AD方面的研究主要集中于相關(guān)復(fù)方中，如：存注丹可緩解老年人健忘[25]，加味癲狂夢(mèng)醒湯聯(lián)合鹽酸多奈哌齊可更有效地改善AD痰瘀互結(jié)證患者的中醫(yī)證候[26]。考慮到中藥揮發(fā)油用于防治情志病具有一定的潛力，加之青皮也用于治療AD的中藥復(fù)方中，故本研究擬探索青皮揮發(fā)油防治AD的潛在靶點(diǎn)與途徑，為進(jìn)一步闡明復(fù)方中單味藥的作用機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

中藥具有多成分、多途徑、多靶點(diǎn)的作用特點(diǎn)，其療效通常取決于其中有效成分群的綜合作用。網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)是一種藥物設(shè)計(jì)的新方法，涉及生物信息學(xué)、多向藥理學(xué)、計(jì)算機(jī)科學(xué)等多學(xué)科的技術(shù)和知識(shí)，可多方位地闡釋藥物治療疾病的潛在靶點(diǎn)及作用機(jī)制，體現(xiàn)了藥物作用的整體性和系統(tǒng)性，與中藥作用特點(diǎn)相一致[27-30]。為此，本研究通過(guò)氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)（GC-MS）對(duì)青皮揮發(fā)油中的活性成分進(jìn)行定性分析，并借助網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的研究思路對(duì)所鑒定出的化學(xué)成分進(jìn)行信息挖掘，篩選出青皮揮發(fā)油防治AD的關(guān)鍵活性成分、關(guān)鍵作用靶點(diǎn)以及潛在信號(hào)通路，旨在為青皮揮發(fā)油用于防治AD的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890A/5975C型GC-MS儀，配電子轟擊（EI）離子源以及5975C-GC/MSD數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)（美國(guó)Agilent公司）;TC-15型恒溫電熱套（海寧市新華醫(yī)療器械廠）;Milli-Q型超純水系統(tǒng)（美國(guó)Millipore公司）。

1.2 藥材與試劑

青皮幼果采自江西省吉安市新干縣山湖鎮(zhèn)青皮種植基地，經(jīng)廣東省中醫(yī)藥科學(xué)院黃志海教授鑒定為蕓香科植物橘（C. reticulata Blanco）的幼果。將其果皮上縱剖成四瓣至基部，除盡瓜瓣，將所得果皮部分自然曬干后，即得四花青皮藥材。無(wú)水硫酸鈉、甲苯、石油醚（60～90 ℃）等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 揮發(fā)油提取

參照2015年版《中國(guó)藥典》（四部）通則中“2204揮發(fā)油測(cè)定法”項(xiàng)下“甲法”操作：稱(chēng)取四花青皮藥材50 g，加10倍量（mL/g）水，浸泡2 h，回流提取9 h，得黃色透明液體，經(jīng)無(wú)水硫酸鈉干燥后，即得青皮揮發(fā)油。平行操作3次。每克藥材可得揮發(fā)油（1.367±0.058） mL。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 GC條件 色譜柱：HP-5MS 5 Phenyl-Methyl Siloxane石英毛細(xì)管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）;升溫程序（初始溫度50.00 ℃，以0.40 ℃/min升至55.92 ℃，以0.20 ℃/min升至58.00 ℃，再以15.00 ℃/min升至88.00 ℃并保持2.00 min;以1.30 ℃/min升至131.70 ℃，以0.80 ℃/min升至137.00 ℃，再以1.50 ℃/min升至148.00 ℃并保持2.00 min;以15.00 ℃/min升至248.00 ℃，以20.00 ℃/min升至280.00 ℃。總運(yùn)行時(shí)間：87.04 min）;進(jìn)樣口溫度：250 ℃;氣化室溫度：250 ℃;載氣（氦氣）流速：1.0 mL/min;進(jìn)樣量：1.0 μL;進(jìn)樣方式：分流進(jìn)樣，分流比：10 ∶ 1。

2.2.2 MS條件 離子源：EI離子源;離子源溫度：230 ℃;四極桿溫度：150 ℃;電子轟擊能量：70 eV;溶劑延遲：3 min;掃描范圍：m/z 50～500。

2.2.3 青皮揮發(fā)油成分分析 取“2.1”項(xiàng)下青皮揮發(fā)油，用適量石油醚溶解后，按“2.2.1”“2.2.2”項(xiàng)下GC-MS條件進(jìn)樣分析，記錄色譜圖和質(zhì)譜數(shù)據(jù)。所得質(zhì)譜數(shù)據(jù)通過(guò)NIST 11.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、匹配后，經(jīng)人工解析并確定各化學(xué)成分的結(jié)構(gòu)。

2.3 網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)分析

2.3.1 青皮揮發(fā)油活性成分的篩選 將“2.2.3”項(xiàng)下已鑒定出的青皮揮發(fā)油成分輸入至中藥系統(tǒng)藥理學(xué)分析平臺(tái)（TCMSP，http：//lsp.nwu.du.cn/tcmsp.php），以口服利用度（OB）≥30%、類(lèi)藥性（DL）≥0.18作為篩選條件[31]對(duì)青皮揮發(fā)油活性成分進(jìn)行篩選。

2.3.2 青皮揮發(fā)油對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的收集 將“2.3.1”項(xiàng)所得青皮揮發(fā)油活性成分錄入TCMSP和PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），限定物種為“人類(lèi)（Homo sapiens）”。將檢索所得各靶點(diǎn)以反向?qū)咏Y(jié)合值（即Fit值）降序排列，選擇前20位作為每個(gè)成分對(duì)應(yīng)的主要靶點(diǎn)[32]。將上述主要靶點(diǎn)錄入U(xiǎn)niProt數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.uniprot.org），限定物種為“人類(lèi)（Homo sapiens）”，檢索相應(yīng)的UniProt ID，并獲取對(duì)應(yīng)的基因簡(jiǎn)稱(chēng)（Gene symbol），去重后即得青皮揮發(fā)油活性成分的對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)。

2.3.3 AD相關(guān)靶點(diǎn)的收集 以“Alzheimers disease”為關(guān)鍵詞，在GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.genecards.org/）、人類(lèi)孟德?tīng)栠z傳數(shù)據(jù)庫(kù)（OMIM，https：//omim.org/）中檢索AD相關(guān)靶點(diǎn)。其中，GeneCards數(shù)據(jù)庫(kù)中以相關(guān)分?jǐn)?shù)（Relevance score）>10為標(biāo)準(zhǔn)[33]進(jìn)行篩選。將兩個(gè)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索結(jié)果去重后，即得AD相關(guān)靶點(diǎn)。

2.3.4 青皮揮發(fā)油防治AD直接靶點(diǎn)的收集 利用Venny 2.1.0軟件映射“2.3.2”“2.3.3”項(xiàng)下所得青皮揮發(fā)油活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)和AD相關(guān)靶點(diǎn)，即得青皮揮發(fā)油防治AD的直接靶點(diǎn)。

2.3.5 青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點(diǎn)的確定 為明確青皮揮發(fā)油成分靶點(diǎn)與疾病AD靶點(diǎn)之間的相互作用關(guān)系，將“2.3.2”“2.3.3”項(xiàng)下所得青皮揮發(fā)油活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)和AD相關(guān)靶點(diǎn)導(dǎo)入STRING數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//string-db.org/），限定物種為“人類(lèi)（Homo sapiens）”，設(shè)置較高置信度（High confidence）≥0.700[34]，除去未相互連接的節(jié)點(diǎn)（Node）后，得“靶點(diǎn)互作”網(wǎng)絡(luò)并保存為“tsv”格式文件;將上述文件導(dǎo)入Cytoscape 7.2.1軟件，運(yùn)用軟件中的“CentiScaPe 2.2”插件計(jì)算節(jié)點(diǎn)度值（Degree），選取度值大于平均度值2倍的靶點(diǎn)作為核心節(jié)點(diǎn)（Hub node）[35]。利用Venny 2.1.0軟件將該核心靶點(diǎn)與“2.3.2”“2.3.3”項(xiàng)下所得青皮揮發(fā)油活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)和AD相關(guān)靶點(diǎn)進(jìn)行映射，選擇與活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)的交集靶點(diǎn)，在排除與“2.3.4”項(xiàng)下直接靶點(diǎn)重復(fù)的靶點(diǎn)之后，即得青皮揮發(fā)油防治AD的間接靶點(diǎn)。將直接靶點(diǎn)與間接靶點(diǎn)合并，即得青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點(diǎn)。

2.3.6 基因本體（GO）功能和KEGG通路富集分析 將“2.3.5”項(xiàng)下所得青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點(diǎn)錄入DAVID 6.7數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//david-d.ncifcrf.gov/summary.jsp），限定物種為“人類(lèi)（Homo sapiens）”，進(jìn)行GO功能富集和KEGG通路富集分析，以P<0.05為顯著富集，且P值越小則顯著性程度越高[36]。將P值由小到大排序，取前10位利用GraphGad Prinsm 7軟件繪制GO功能富集柱狀圖（即二級(jí)分類(lèi)柱狀圖，包括細(xì)胞組分、分子功能、生物過(guò)程）;將P值由小到大排序，利用OmicShare在線工具（http：//www.omicshare.com/）繪制KEGG通路富集氣泡圖。

2.3.7 關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選 將“2.3.5”項(xiàng)下所得青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點(diǎn)及相應(yīng)活性成分通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建青皮揮發(fā)油的“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，并運(yùn)用軟件中“CentiScaPe 2.2”插件進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，計(jì)算節(jié)點(diǎn)度值、介數(shù)中心度（Betweenness centrality）和緊密中心度（Closeness centrality），并選擇上述參數(shù)均大于其對(duì)應(yīng)均值的成分和靶點(diǎn)作為青皮揮發(fā)油抗AD的關(guān)鍵成分和關(guān)鍵靶點(diǎn)[35]，再通過(guò)Cytoscape 3.7.1軟件構(gòu)建“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)，進(jìn)行可視化展示。

3 結(jié)果

3.1 青皮揮發(fā)油GC-MS分析結(jié)果

青皮揮發(fā)油GC-MS總離子流圖見(jiàn)圖1。經(jīng)NIST 11.L質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫(kù)檢索、匹配和人工解析后，共鑒定出40個(gè)成分（匹配度均大于80%），大多為萜烯類(lèi)、不飽和醇類(lèi)、酯類(lèi)、長(zhǎng)鏈烷烴類(lèi)以及苯類(lèi)化合物，如右旋檸檬烯、 γ-萜品烯、芳樟醇、β-月桂烯等，詳見(jiàn)表1。

3.2 青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

表1中，所有化學(xué)成分的OB值均大于30%;除（-）-4-萜品醇的DL值為0.11外，其余化學(xué)成分的DL值均大于0.18。考慮到（-）-4-萜品醇對(duì)情志病具有一定的治療作用[37-38]，故本研究將包含其在內(nèi)的40個(gè)化學(xué)成分作為活性成分全部導(dǎo)入TCMSP和PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)，并分別收集到273、760個(gè)靶點(diǎn);經(jīng)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)校正、去重后得到青皮揮發(fā)油活性成分對(duì)應(yīng)靶點(diǎn)151個(gè)。以“Alzheimers disease”為關(guān)鍵詞，在GeneCards和OMIM數(shù)據(jù)庫(kù)中共收集到AD相關(guān)靶點(diǎn)1 291個(gè)。經(jīng)Venny 2.1.0軟件映射后，共得到青皮揮發(fā)油防治AD直接靶點(diǎn)48個(gè)。

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)和Cytospace 3.7.1軟件共篩選出大于平均度值（21.866）2倍的核心節(jié)點(diǎn)401個(gè)（“靶點(diǎn)互作”網(wǎng)絡(luò)圖略）;經(jīng)Venny 2.1.0軟件映射后，共得到間接靶點(diǎn)41個(gè)。將直接靶點(diǎn)和間接靶點(diǎn)合并，即得青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點(diǎn)89個(gè)，詳見(jiàn)圖2。

3.3 GO功能富集和KEGG通路富集結(jié)果

GO功能富集結(jié)果顯示，89個(gè)作用靶點(diǎn)主要涉及GO功能過(guò)程564個(gè)（P<0.05）。其中，生物過(guò)程富集440個(gè)，以有機(jī)物的反應(yīng)（Response to organic substance）、對(duì)內(nèi)生刺激的反應(yīng)（Response to endogenous stimulus）、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)（Intracellular signaling cascade）等為主;細(xì)胞組分富集43個(gè)，以細(xì)胞分?jǐn)?shù)（Cell fraction）、軸突（Axon）、胞漿（Cytosol）、不溶性組分（Insoluble fraction）等為主;分子功能富集81個(gè)，以胺受體活性（Amine receptor activity）、蛋白激酶活性（Protein kinase activity）、胺結(jié)合（Amine binding）、腎上腺素受體活性（Adrenoceptor activity）等為主，詳見(jiàn)圖3。

KEGG通路富集結(jié)果顯示，89個(gè)作用靶點(diǎn)主要富集于19條通路上（P<0.05），以癌癥通路（Pathways in cancer）、局灶性粘連（Focal adhesion）、結(jié)直腸癌（Colorectal cancer）、鈣信號(hào)通路（Calcium signaling pathway）、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路（Neurotrophin signaling pathway）等為主，詳見(jiàn)圖4。

3.4 青皮揮發(fā)油防治AD關(guān)鍵成分及關(guān)鍵靶點(diǎn)的篩選結(jié)果

“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)（圖略）中，介數(shù)中心度、緊密中心度和節(jié)點(diǎn)度值均大于其對(duì)應(yīng)平均值（上述參數(shù)的平均值分別為456.201 7、0.003 130、14.900）的關(guān)鍵成分有10個(gè)，分別為α-萜品烯、β-elemen、百里酚、（-）-4-萜品醇、右旋檸檬烯、乙酸橙花酯、香葉醇、Cis-2，8-menthadien-1-ol、β-松油醇、Cis-carveol，節(jié)點(diǎn)度值分別為31.000、27.000、26.000、25.000、21.000、19.000、19.000、17.000、17.000、17.000。其中，α-萜品烯、β-elemen、百里酚、（-）-4-萜品醇的節(jié)點(diǎn)度遠(yuǎn)高于其他成分。

介數(shù)中心度、緊密中心度和節(jié)點(diǎn)度值均大于其對(duì)應(yīng)平均值（上述參數(shù)的平均值分別為134.561 8、0.002 679、6.700）的關(guān)鍵靶點(diǎn)有21個(gè)，分別為血清白蛋白（ALB）、載脂蛋白A-Ⅱ（APOA2）、胱天蛋白酶7（CASP7）、碳酸酐酶2（CA2）、維生素D結(jié)合蛋白（GC）、類(lèi)驅(qū)動(dòng)蛋白KIF11（KIF11）、骨形態(tài)發(fā)生蛋白2（BMP2）、β-分泌酶1（BACE1）、鈉依賴(lài)性多巴胺轉(zhuǎn)運(yùn)體（SLC6A3）、雄激素受體（AR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、凝血酶原（F2）、毒蕈堿乙酰膽堿受體M1（CHRM1）、γ-氨基丁酸受體α-2亞單位（GABRA2）、CHRM2、二肽基肽酶4（DPP4）、絲裂原活化蛋白激酶10（MAPK10）、孕酮受體（PGR）、MAPK8、CHRM3，節(jié)點(diǎn)度值分別為34.000、27.000、24.000、22.000、21.000、21.000、20.000、17.000、16.000、16.000、16.000、15.000、14.000、14.000、13.000、13.000、12.000、12.000、10.000、10.000、9.000。其中，AR、PTGS2、MAPK14、CHRM1、CHRM2、MAPK10、PGR、MAPK8、CHRM3富集于“3.3”項(xiàng)下所得的19條KEGG通路上。青皮揮發(fā)油防治AD的“關(guān)鍵成分-關(guān)鍵靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)見(jiàn)圖5。

4 討論

本研究結(jié)合GC-MS技術(shù)與網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步探討了青皮揮發(fā)油防治AD的潛在活性成分以及分子作用機(jī)制。通過(guò)GC-MS分析，共鑒定出匹配度較高的活性成分40個(gè);通過(guò)TCMSP、PharmMapper數(shù)據(jù)庫(kù)和軟件映射后，共得到青皮揮發(fā)油防治AD作用靶點(diǎn)89個(gè)。

GO富集結(jié)果顯示，89個(gè)作用靶點(diǎn)主要分布于564個(gè)GO功能過(guò)程。筆者結(jié)合AD的發(fā)病機(jī)制分析發(fā)現(xiàn)，蛋白激酶可通過(guò)抑制Tau蛋白的過(guò)度磷酸化而保護(hù)神經(jīng)元[39];突觸的胞外信號(hào)可引起胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)，并參與調(diào)節(jié)基因功能[40]，均與AD發(fā)生有關(guān)。本研究GO富集結(jié)果顯示，89個(gè)作用靶點(diǎn)主要富集于蛋白激酶活性、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)級(jí)聯(lián)等生物過(guò)程及分子功能，與上述研究基本一致，提示青皮揮發(fā)油可能通過(guò)上述途徑防治AD。有研究指出，鈣離子濃度過(guò)高，可激活蛋白激酶，從而引起Tau蛋白的過(guò)度磷酸化;鈣離子濃度過(guò)低，則會(huì)導(dǎo)致依賴(lài)鈣的相關(guān)酶活性降低，造成β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積[41];鈣離子失調(diào)還會(huì)引起活性氧等下游物質(zhì)含量升高，誘發(fā)體內(nèi)氧化應(yīng)激，最終導(dǎo)致神經(jīng)元凋亡[42-43]。神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素是神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，也是與神經(jīng)細(xì)胞存活相關(guān)的生長(zhǎng)因子，其家族成員之一的腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子主要分布于大腦中樞神經(jīng)系統(tǒng)，與學(xué)習(xí)以及記憶能力密切相關(guān)[44-45]。此外，徐倩等[27]通過(guò)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，AD的差異表達(dá)基因主要富集于癌癥通路，還涉及結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌等通路。本研究KEGG富集結(jié)果顯示，89個(gè)作用靶點(diǎn)主要富集于鈣信號(hào)通路、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素信號(hào)通路以及癌癥通路等信號(hào)通路上，提示青皮揮發(fā)油可能通過(guò)上述通路發(fā)揮對(duì)AD的防治作用。此外，局灶性粘連、結(jié)直腸癌等癌癥通路也可作為青皮揮發(fā)油防治AD的潛在靶點(diǎn)，但具體機(jī)制有待后續(xù)深入研究。

通過(guò)對(duì)“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，共篩選出關(guān)鍵成分10個(gè)。在篩選出的10個(gè)關(guān)鍵成分中，右旋檸檬烯是青皮揮發(fā)油測(cè)定結(jié)果中峰面積最大的活性成分，且匹配度達(dá)99%;γ-萜品烯作為青皮揮發(fā)油測(cè)定結(jié)果中峰面積第二大的成分，有研究指出其與百里酚聯(lián)用后可增強(qiáng)乙酰膽堿水平及煙堿型乙酰膽堿的反應(yīng)性[46]。α-萜品烯為“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)中節(jié)點(diǎn)度值最高的成分，具有很好的抗氧化活性，并可有效抑制脂氧合酶和乙酰膽堿酯酶的活性[47]。有研究指出，百里酚對(duì)Aβ致海馬突觸損傷的高脂模型大鼠具有一定的保護(hù)和治療作用[48-49]。（-）-4-萜品醇可通過(guò)抑制丁酰膽堿酯酶的活性來(lái)發(fā)揮對(duì)AD的治療作用[37];且有研究顯示，富含（-）-4-萜品醇的朝鮮冷杉揮發(fā)油可有效提高莨菪堿誘導(dǎo)的健忘模型大鼠的記憶力[38]。由此可見(jiàn)，青皮揮發(fā)油在防治AD方面具有較好的物質(zhì)基礎(chǔ)。

通過(guò)對(duì)“活性成分-作用靶點(diǎn)”網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)鋵W(xué)分析，共篩選出關(guān)鍵靶點(diǎn)21個(gè)。目前，AD的發(fā)病機(jī)理雖未完全明確，但現(xiàn)代醫(yī)學(xué)普遍認(rèn)為，AD的發(fā)生與Aβ沉積、Tau蛋白過(guò)度磷酸化、炎癥反應(yīng)、膽堿能、物質(zhì)能量代謝等因素有關(guān)[50-51]。在篩選出的21個(gè)關(guān)鍵靶點(diǎn)中，ALB的節(jié)點(diǎn)度值最高，亦遠(yuǎn)高于其余節(jié)點(diǎn)。有研究發(fā)現(xiàn)，ALB可有效抑制Aβ的聚集，從而緩解AD癥狀[52]。本研究還發(fā)現(xiàn)，AR、PTGS2、MAPK14、CHRM1、CHRM2、MAPK10、PGR、MAPK8、CHRM3等9個(gè)作用靶點(diǎn)富集于19條KEGG通路上。CHR廣泛存在于大腦中，其中CHRM1可緩解Aβ所致的興奮性神經(jīng)毒性，并緩解AD模型小鼠的認(rèn)知障礙[53-54];CHRM2與智力、人格特征以及抑郁等有關(guān)[55]，均是AD治療的潛在靶點(diǎn)。MAPK14與炎癥反應(yīng)的發(fā)生密切相關(guān)，且其表達(dá)量在AD模型大鼠體內(nèi)明顯升高[56]，亦可能成為治療AD的作用靶點(diǎn)之一。PTGS2已被初步證實(shí)為杜仲植物雌激素類(lèi)成分治療AD[57]以及酸棗仁湯治療失眠[58]的主要靶點(diǎn)之一。孕酮是一種重要的內(nèi)源性神經(jīng)元載體，不僅對(duì)生殖系統(tǒng)具有重要意義，而且還可通過(guò)提高神經(jīng)元存活率、抑制炎癥反應(yīng)、改善腦缺血和腦損傷等途徑調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)功能[59-60]，但關(guān)于孕酮及其受體發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用的機(jī)制尚不完全清楚，有待后續(xù)研究予以證實(shí)。

綜上所述，本研究借助GC-MS技術(shù)和網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，初步篩選了青皮揮發(fā)油防治AD的活性成分及潛在作用靶點(diǎn)，為中藥揮發(fā)油防治AD等情志類(lèi)疾病的研究以及后續(xù)實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)指標(biāo)的篩選等提供了思路與理論依據(jù)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 國(guó)家藥典委員會(huì).中華人民共和國(guó)藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國(guó)醫(yī)藥科技出版社，2015：197.

[ 2 ] 靳貝貝，裴香萍，梁惠珍.青皮藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類(lèi)分析和主成分分析[J].中國(guó)藥房，2018，29（24）：3336-3339.

[ 3 ] 馮永輝，馮娟.淺談陳皮常見(jiàn)藥對(duì)的配伍應(yīng)用[J].陜西中醫(yī)，2011，32（7）：906-907.

[ 4 ] 陳紅，劉傳玉，李承晏.青皮的化學(xué)及藥理作用研究進(jìn)展[J].中草藥，2001，32（11）：1051-1052.

[ 5 ] 劉恒，馬永明，瞿頌義，等.青皮對(duì)大鼠離體子宮平滑肌運(yùn)動(dòng)的影響[J].中草藥，2000，31（3）：203-205.

[ 6 ] 陳青，鐘宏波.黔產(chǎn)青皮揮發(fā)油化學(xué)成分及抑菌活性研究[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2011，17（9）：118-121.

[ 7 ] 高順平，鄔國(guó)棟，劉全禮.青皮的研究進(jìn)展[J].包頭醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2014，30（1）：139-141.

[ 8 ] 徐小娜，蔣軍輝，王永生，等. GC-MS和HELP法分析藥對(duì)陳皮-青皮與其單味藥揮發(fā)油成分[J].分析測(cè)試學(xué)報(bào)，2012，31（10）：1277-1281.

[ 9 ] TIRADO CB，STASHENKO EE，COMBARIZA MY，et al. Comparative study of Colombian citrus oils by high-resolution gas chromatography and gas chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A，1995，697（1）：501-513.

[10] FLAMINI G，TEBANO M，CIONI PL. Volatiles emission patterns of different plant organs and pollen of Citrus limon[J]. Anal Chim Acta，2007，589（1）：120-124.

[11] WANG Y，YI L，LIANG Y，et al. Comparative analysis of essential oil components in Pericarpium Citri Reticulatae Viride and Pericarpium Citri Reticulatae by GC-MS combined with chemometric resolution method[J]. J Pharm Biomed Anal，2008，46（1）：66-74.

[12] KANG SA，PARK HJ，KIM M，et al. Citri Reticulatae Viride Pericarpium extract induced apoptosis in SNU-C4 human colon cancer cells[J]. J Ethnopharmacol，2005，97（2）：231-235.

[13] ASAMOTO M，TORIYAMA-BABA H，OHNISHI T，et al. Transgenic rats carrying human c-Ha-ras proto-oncogene are highly susceptible to N-nitrosomethylbenzy- lamine induction of esophageal tumorigenesis[J]. Jpn J Cancer Res，2002，93（7）：744-751.

[14] BEZERRA DP，COSTA EV，NOGUEIRA PCL. Essential oil constituents：biodiversity and their applicability for cancer therapy[M]. Berlin：Springer-Verlag，2013：285- 300.

[15] DAO TP，TRAN TH，NGUYEN PTN，et al. Chemical composition and evaluation of antibacterial activities of essential oil from lemon （Citrus aurantifolia L.） leaves growing Tien Giang Province，Vietnam [J]. Asian J Chem，2019，31（10）：2284-2286.

[16] COSENTINO S，TUBEROSO CIG，PISANO B，et al. In- vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinian Thymus essential oils[J]. Lett Appl Micro Biol，1999，29（2）：130-135.

[17] 黃龍艦，趙春陽(yáng)，馮新紅，等.抗阿爾茨海默病藥物非臨床藥效學(xué)評(píng)價(jià)體系的探索[J].藥學(xué)學(xué)報(bào)，2020，55（5）：789-805.

[18] 李慧婷，李遠(yuǎn)輝，任桂林，等.中藥揮發(fā)油防治情志疾病的研究現(xiàn)狀及前景展望[J].中草藥，2019，50（17）：4031- 4040.

[19] 李艷萍，李海燕，紀(jì)曉婉，等.金釵石斛葉中總黃酮的提取分離及體外抗阿爾茨海默病活性研究[J].中國(guó)藥房，2018，29（3）：330-333.

[20] 鄭家歡.藥用植物揮發(fā)油的提取及抗抑郁活性研究[D].廣州：廣東藥科大學(xué)，2017.

[21] 馮波，靖慧軍，郭敏娟，等.石菖蒲揮發(fā)油和水煎液的抗焦慮作用[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2014，20（9）：207-210.

[22] 賀利敏.自閉癥小鼠神經(jīng)行為學(xué)觀察及辛夷揮發(fā)油對(duì)其學(xué)習(xí)記憶行為影響研究[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2016.

[23] 齊越，劉冉，賈冬，等.溫郁金揮發(fā)油對(duì)Aβ25-35致阿爾茲海默病小鼠模型行為學(xué)的影響[J].實(shí)驗(yàn)動(dòng)物科學(xué)，2017，34（5）：23-27.

[24] 王虎平，吳紅彥，李海龍，等.當(dāng)歸有效組分防治阿爾茨海默病模型大鼠組方配伍優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)研究[J].甘肅中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，36（3）：12-19.

[25] 劉根.運(yùn)用數(shù)據(jù)挖掘方法對(duì)益智抗老年性癡呆類(lèi)方劑核心藥物組合的篩選研究[D].太原：山西中醫(yī)學(xué)院，2016.

[26] 顧彥琳.加味癲狂夢(mèng)醒湯治療阿爾茨海默病痰瘀互結(jié)證臨床療效的觀察[D].長(zhǎng)沙：湖南中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[27] 徐倩，蘇湲淇，譚毅，等.阿爾茨海默病相關(guān)差異表達(dá)基因及其生物信息學(xué)分析[J].中國(guó)藥房，2019，30（24）：3423-3427.

[28] 趙杰，許波，劉金豹，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討牛膝治療骨質(zhì)疏松的潛在有效成分及作用機(jī)制[J].中國(guó)藥房，2019，30（22）：3090-3095.

[29] 劉丹凱，王凱，魏賑權(quán)，等.昆明山海棠-雞血藤藥對(duì)治療類(lèi)風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎作用機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究[J].中國(guó)藥房，2019，30（19）：2639-2644.

[30] 劉樹(shù)森，孫文斌，李文蘭，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的黃連-吳茱萸藥對(duì)抗癌及治療心腦血管疾病機(jī)制研究[J].中草藥，2020，51（1）：109-117.

[31] 孫曉麗，楊若聰，劉俊杰，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究龍生蛭膠囊抗腦卒中的作用機(jī)制[J].中華中醫(yī)藥雜志，2019，34（5）：2165-2168.

[32] ZHUANG Y，QIN K，YANG B，et al. Prediction of the targets of the main components in blood after oral administration of Xanthii Fructus：a network pharmacology study[J]. RSC Advances，2018，8（16）：8870-8877.

[33] 逯克娜，林寒梅，黃巍，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的化痰通脈飲“半夏-當(dāng)歸”藥對(duì)抗多囊卵巢綜合征作用機(jī)制的研究[J].時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2019，30（3）：539-543.

[34] ZHU J，YI X，ZHANG Y，et al. Systems pharmacology- based approach to comparatively study the independent and synergistic mechanisms of danhong injection and naoxintong capsule in ischemic stroke treatment[J]. Evid- Based Complement Altern，2019. DOI：10.1155/2019/1056708.

[35] 伊?xí)詪?基于系統(tǒng)生物學(xué)方法的丹紅注射液抗阿霉素心肌毒性作用機(jī)制研究[D].杭州：浙江大學(xué)，2019.

[36] 甘東浩，陳德強(qiáng)，馮蓬，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)探討骨碎補(bǔ)抗骨質(zhì)疏松的物質(zhì)基礎(chǔ)及作用機(jī)制[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2019，25（13）：186-191.

[37] BONESI M，MENICHINI F，TUNDIS R，et al. Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitory activity of Pinus species essential oils and their constituents[J]. J Enzym Inhib Med Chem，2010，25（5）：622-628.

[38] KIM K，BU Y，JEONG S，et al. Memory-enhancing effect of a supercritical carbon dioxide fluid extract of the needles of Abies koreana on scopolamine-induced amnesia in mice[J]. Biosci Biotech Biochem，2006，70（8）：1821- 1826.

[39] MOHANDAS E，RAJMOHAN V，RAGHUNATH B. Neurobiology of Alzheimers disease[J]. Indian J Psychiatry，2009，51（1）：55-61.

[40] ARPITA K，ASHISH K，BRYAN M，et al. A serine protea- se KLK8 emerges as a regulator of regulators in memory：microtubule protein dependent neuronal morphology and PKA-CREB signaling[J]. Sci Rep，2018. DOI：10. 1038/s41598-018-27640-6.

[41] 汪亞楠，李思齊，岳一強(qiáng)，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的苓桂術(shù)甘湯治療阿爾茨海默病的潛在作用機(jī)制研究[J].中草藥，2019，50（23）：5812-5122.

[42] WATER BVD，ZOETEWEIJ JP，BONT HJD，et al. Role of mitochondrial Ca2+ in the oxidative stress-induced dissipation of the mitochondrial membrane potential：studies in isolated proximal tubular cells using the nephrotoxin 1，2-dichlorovinyl-L-cysteine[J]. J Biol Chem，1994，269（20）：14546-14552.

[43] 胡倩，劉育鋮，毛思宇，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)對(duì)白術(shù)治療阿爾茨海默癥的機(jī)制探討[J].中南藥學(xué)，2020，18（3）：427-434.

[44] 劉邵陽(yáng)，白辰，徐競(jìng)男，等.基于網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法探索達(dá)原飲治療發(fā)熱作用機(jī)制[J].中國(guó)中醫(yī)藥信息雜志，2020，27（5）：84-89.

[45] 郁俊昌，唐牟尼，韓海英，等.阿爾茨海默病、血管性癡呆及輕度認(rèn)知障礙患者血漿腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子濃度變化[J].實(shí)用醫(yī)學(xué)雜志，2013，29（9）：1429-1431.

[46] SAMMI SR，TRIVEDI S，RATH SK，et al. 1-methyl-4- propan-2-ylbenzene from Thymus vulgaris attenuates cholinergic dysfunction[J]. Mol Neurobiol，2016，54（7）：5468-5481.

[47] CUTILLAS AB，CARRASCO A，MARTINEZ-GUTIERREZ R，et al. Thymus mastichina L. essential oils from Murcia （Spain）：composition and antioxidant，antienzymatic and antimicrobial bioactivities[J]. PLoS One，2018. DOI：10.1371/journal.pone.0190790.

[48] ASADBEGI M，YAGHMAEI P，SALEHI I，et al. Investigation of thymol effect on learning and memory impairment induced by intrahippocampal injection of amyloid beta peptide in high fat diet-fed rats[J]. Metab Brain Dis，2017，32（3）：827-839.

[49] ASADBEGI M，KOMAKI A，SALEHI I，et al. Effects of thymol on amyloid-β-induced impairments in hippocampal synaptic plasticity in rats fed a high-fat diet[J]. Brain Res Bull，2018. DOI：10.1016/j.brainresbull.2018.01.008.

[50] 王濤.阿爾茨海默癥Ch4腦區(qū)相關(guān)的遺傳變異位點(diǎn)的識(shí)別與分析[D].哈爾濱：哈爾濱工業(yè)大學(xué)，2019.

[51] 羅俊.石菖蒲-益智仁精油提取工藝及精油吸嗅給藥對(duì)AD的作用研究[D].南昌：江西中醫(yī)藥大學(xué)，2019.

[52] XIE B，LI X，DONG XY，et al. Insight into the inhibition effect of acidulated serum albumin on amyloid β-protein fibrillogenesis and cytotoxicity[J]. Langmuir，2014，30（32）：9789-9796.

[53] GU Z，ZHONG P，YAN Z. Activation of muscarinic receptors inhibits beta-amyloid peptide-induced signaling in cortical slices[J]. J Biol Chem，2003，278（19）：17546- 17556.

[54] 畢丹蕾，文朗，熊偉，等.阿爾茨海默病的可能藥物靶點(diǎn)和臨床治療研究進(jìn)展[J].中國(guó)藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志，2015，29（4）：507-536.

[55] CHEE LY，CUMMING A. Polymorphisms in the cholinergic receptors muscarinic （CHRM2 and CHRM3） genes and Alzheimers disease[J]. Avicenna J Med Biotechnol，2018，10（3）：196-199.

[56] QILING JI，XUEMEI WANG，CAI J. MiR-22-3p regulates amyloid β deposit in mice model of Alzheimers disease by targeting mitogen-activated protein kinase 14[J]. Curr Neurovasc Res，2019，16（5）：473-480.

[57] 王晶，劉斌，薛慧，等.基于整合藥理學(xué)平臺(tái)的杜仲植物雌激素類(lèi)成分治療AD的作用機(jī)制研究[J].現(xiàn)代中藥研究與實(shí)踐，2019，33（1）：30-34.

[58] 鄺梓君，湯順莉，黃雁，等.酸棗仁湯治療失眠的有效成分預(yù)測(cè)與靶點(diǎn)通路分析[J].中華中醫(yī)藥雜志，2018，33（8）：3585-3590.

[59] 秦亞彬.孕酮對(duì)Aβ所致神經(jīng)元損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2015.

[60] 孫爽.孕酮對(duì)AD細(xì)胞模型及動(dòng)物模型神經(jīng)再生的影響及機(jī)制研究[D].石家莊：河北醫(yī)科大學(xué)，2018.

（收稿日期：2020-02-07 修回日期：2020-07-07）

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