基于GC-MS與網絡藥理學的青皮揮發油防治阿爾茨海默癥的活性成分及作用機制研究

王騰華 羅穎懿 王馭辰 任之堯 唐建新 李詠梅 方翼 吳波

摘 要 目的：預測青皮揮發油防治阿爾茨海默病（AD）的主要活性成分和潛在作用靶點。方法：采用氣質聯用技術（GC-MS）分析青皮揮發油化學成分，并借助NIST 11.L數據庫和人工數據解析進行成分的結構鑒定。借助中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP）、PharmMapper數據庫等預測青皮揮發油活性成分及其對應靶點，借助GeneCards數據庫、人類孟德爾遺傳數據庫等挖掘AD相關靶點;利用Venny 2.1.0軟件映射以獲取青皮揮發油防治AD的直接靶點;借助STRING數據庫和Cytoscape 7.2.1軟件挖掘核心節點，利用Venny 2.1.0軟件映射并去重后獲取青皮揮發油防治AD的間接靶點;借助DAVID 6.7數據庫對上述直接和間接靶點（即作用靶點）進行基因本體（GO）功能富集和KEGG通路富集分析;采用Cytoscape 7.2.1軟件，以節點度值、介數中心度、緊密中心度為指標，對青皮揮發油“活性成分-作用靶點”網絡進行拓撲學分析，挖掘關鍵成分和關鍵靶點。結果與結論：GC-MS法共分離并鑒定出青皮揮發油化學成分40個，均為活性成分，包括右旋檸檬烯、γ-萜品烯等。共挖掘出活性成分對應靶點151個、AD相關靶點1 291個，其中直接靶點48個、間接靶點41個。上述89個作用靶點主要富集于細胞分數、軸突、胞漿等細胞組分，細胞內信號級聯、對有機物的反應等生物過程，蛋白激酶活性、胺受體活性等分子功能，以及癌癥通路、鈣信號通路、神經營養素信號通路等信號通路（P<0.05）。共挖掘出α-萜品烯、β-elemen、百里酚、（-）-4-萜品醇等關鍵成分10個，雄激素受體（AR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶14、毒蕈堿乙酰膽堿受體M1等關鍵靶點21個，表明青皮揮發油防治AD呈多成分、多靶點、多通路的作用特點。

關鍵詞 青皮;揮發油;氣質聯用技術;網絡藥理學;阿爾茨海默病;機制

ABSTRACT ? OBJECTIVE： To predict the active components and potential target of volatile oil of Citri reticulatae preventing and treating Alzheimers disease （AD）. METHODS： The volatile oil of C. reticulatae was determined by GC-MS， and identified according to NIST 11.L database and manual data analysis. The active components and targets of volatile oil of C. reticulatae were predicted through TCMSP and PharmMapper database. The related targets of AD were obtained by using GeneCards and OMIM databases. Venny 2.1.0 software mapping was used to obtain the direct targets of volatile oil of C. reticulatae against AD. Core nodes were mined with STRING database and Cytoscape 7.2.1 software， and? the indirect targets of volatile oil of C. reticulatae against AD were obtained by mapping and duplication coith Venny 2.1.0 software. With the help of DAVID 6.7 database， the above direct and indirect targets （i.e. action targets） were used for gene ontology （GO） function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis. Using Cytoscape 7.2.1 software， topology analysis was conducted for the network of “active components-acting targets” of volatile oil of C. reticulatae， with node degree value， betweenness centrality and closeness centrality as indexes， then key components and key targets were mined. RESULTS & CONCLUSIONS： A total of 40 chemical components in volatile oil were identified by GC-MS， all of them were active components， including D-limonene， γ-terpinene， etc. A total of 151 active components-corresponding targets and 1 291 AD-related targets were mined， including 48 direct targets and 41 indirect targets. The above 89 targets were mainly concentrated in cell fraction， axon， cytosol and other cell components; intracellular signaling cascade， response to organic substance and other biological processes; protein kinase activity and amine receptor activity and other molecular functions; as well as cancer pathway， calcium signaling pathway and neurotrophin signaling pathway （P<0.05）. A total of 10 key components including α-terpinene， β-elemen， thymol and （-）-4-terpineol， as well as 21 key targets such as androgen receptor， prostaglandin G/H synthase 2， mitogen activated protein kinase 14， muscarinic acetylcholine receptor M1 were excavated， indicating the effect of volatile oil of C. reticulatae against AD had the characteristics of multi-component， multi-target and multi-channel.

KEYWORDS? ?Citri reticulatae; Volatile oil; GC-MS; Network pharmacology; Alzheimers disease; Mechanism

青皮為蕓香科植物橘（Citrus reticulata Blanco）及其栽培變種的干燥幼果或未成熟果實的果皮。其中，5～6月收集自落的幼果曬干者，習稱“個青皮”;7～8月采收未成熟的果實，在果皮上縱剖成四瓣至基部，除盡瓜瓣后曬干者，習稱“四花青皮”[1]。除橘類未成熟果實的果皮外，其同屬植物甜橙[C. sinensis（Linn.）Osbeck]、枸櫞（C. medica L.）以及茶枝柑（C. reticulata Blanco cv. Chachiensis）等柑類未成熟果實的果皮在有的地區亦作青皮使用[2]。青皮味辛、苦，性微溫，沉降下行，偏于疏肝膽氣分，有破氣行痰、消積化滯之功效[3]，對心腦血管、消化系統、呼吸系統[4]及平滑肌[5]均具有廣泛的藥理作用，主要用于治療肝氣郁滯、疝氣、胸脅胃脘疼痛、食積、乳房脹痛、脘悶噯氣、久瘧癖塊等癥[6-7]。青皮揮發油為其主要藥效成分之一，具有理氣、調氣和抗菌等活性[8-10]。其中，D-檸檬烯是青皮發揮理氣作用的主要有效成分，同時還兼具祛痰、抗腫瘤[11-14]和廣譜抗菌[15]等作用;對傘花烴、芳樟醇、α-萜品醇以及檸檬醛等是青皮發揮調氣作用的主要成分[4]，且α-萜品醇還具有顯著的抗菌作用[16]。

阿爾茨海默病（Alzheimers disease，AD）是一種中樞神經退行性疾病，也是老年癡呆中較常見的類型之一。現有治療藥物的效果欠佳[17]，其中常用的乙酰膽堿酯酶抑制劑等化學藥物作用靶點單一，且長期服用會引發副作用和成癮性[18]。因此，多靶點抗AD研究已成為相關藥物研發的熱門方向[19]。中藥具有豐富的藥理活性，可通過多通路、多靶點發揮治療作用[4]。中藥揮發油是中藥材中一種具有揮發性的油狀液體，易透過血腦屏障并迅速入腦，具有藥理活性豐富、起效靶點多、不良反應較少且癥狀輕微等特點;同時，其獨特的芳香氣味容易讓患者接受并在治療過程中產生愉悅感[18]。可見，中藥揮發油在防治AD領域中可能具有較大潛力。已有研究顯示，羅勒揮發油可抗抑郁[20]，石菖蒲揮發油可抗焦慮[21]，辛夷、溫郁金揮發油可改善實驗動物的學習記憶能力[22-23]，當歸揮發油可提高記憶力、防治AD[24]等。有關青皮揮發油防治AD方面的研究主要集中于相關復方中，如：存注丹可緩解老年人健忘[25]，加味癲狂夢醒湯聯合鹽酸多奈哌齊可更有效地改善AD痰瘀互結證患者的中醫證候[26]。考慮到中藥揮發油用于防治情志病具有一定的潛力，加之青皮也用于治療AD的中藥復方中，故本研究擬探索青皮揮發油防治AD的潛在靶點與途徑，為進一步闡明復方中單味藥的作用機制奠定基礎。

中藥具有多成分、多途徑、多靶點的作用特點，其療效通常取決于其中有效成分群的綜合作用。網絡藥理學是一種藥物設計的新方法，涉及生物信息學、多向藥理學、計算機科學等多學科的技術和知識，可多方位地闡釋藥物治療疾病的潛在靶點及作用機制，體現了藥物作用的整體性和系統性，與中藥作用特點相一致[27-30]。為此，本研究通過氣質聯用技術（GC-MS）對青皮揮發油中的活性成分進行定性分析，并借助網絡藥理學的研究思路對所鑒定出的化學成分進行信息挖掘，篩選出青皮揮發油防治AD的關鍵活性成分、關鍵作用靶點以及潛在信號通路，旨在為青皮揮發油用于防治AD的深入研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

7890A/5975C型GC-MS儀，配電子轟擊（EI）離子源以及5975C-GC/MSD數據處理系統（美國Agilent公司）;TC-15型恒溫電熱套（海寧市新華醫療器械廠）;Milli-Q型超純水系統（美國Millipore公司）。

1.2 藥材與試劑

青皮幼果采自江西省吉安市新干縣山湖鎮青皮種植基地，經廣東省中醫藥科學院黃志海教授鑒定為蕓香科植物橘（C. reticulata Blanco）的幼果。將其果皮上縱剖成四瓣至基部，除盡瓜瓣，將所得果皮部分自然曬干后，即得四花青皮藥材。無水硫酸鈉、甲苯、石油醚（60～90 ℃）等試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法

2.1 揮發油提取

參照2015年版《中國藥典》（四部）通則中“2204揮發油測定法”項下“甲法”操作：稱取四花青皮藥材50 g，加10倍量（mL/g）水，浸泡2 h，回流提取9 h，得黃色透明液體，經無水硫酸鈉干燥后，即得青皮揮發油。平行操作3次。每克藥材可得揮發油（1.367±0.058） mL。

2.2 GC-MS分析

2.2.1 GC條件 色譜柱：HP-5MS 5 Phenyl-Methyl Siloxane石英毛細管柱（30 m×250 μm，0.25 μm）;升溫程序（初始溫度50.00 ℃，以0.40 ℃/min升至55.92 ℃，以0.20 ℃/min升至58.00 ℃，再以15.00 ℃/min升至88.00 ℃并保持2.00 min;以1.30 ℃/min升至131.70 ℃，以0.80 ℃/min升至137.00 ℃，再以1.50 ℃/min升至148.00 ℃并保持2.00 min;以15.00 ℃/min升至248.00 ℃，以20.00 ℃/min升至280.00 ℃。總運行時間：87.04 min）;進樣口溫度：250 ℃;氣化室溫度：250 ℃;載氣（氦氣）流速：1.0 mL/min;進樣量：1.0 μL;進樣方式：分流進樣，分流比：10 ∶ 1。

2.2.2 MS條件 離子源：EI離子源;離子源溫度：230 ℃;四極桿溫度：150 ℃;電子轟擊能量：70 eV;溶劑延遲：3 min;掃描范圍：m/z 50～500。

2.2.3 青皮揮發油成分分析 取“2.1”項下青皮揮發油，用適量石油醚溶解后，按“2.2.1”“2.2.2”項下GC-MS條件進樣分析，記錄色譜圖和質譜數據。所得質譜數據通過NIST 11.L質譜數據庫檢索、匹配后，經人工解析并確定各化學成分的結構。

2.3 網絡藥理學分析

2.3.1 青皮揮發油活性成分的篩選 將“2.2.3”項下已鑒定出的青皮揮發油成分輸入至中藥系統藥理學分析平臺（TCMSP，http：//lsp.nwu.du.cn/tcmsp.php），以口服利用度（OB）≥30%、類藥性（DL）≥0.18作為篩選條件[31]對青皮揮發油活性成分進行篩選。

2.3.2 青皮揮發油對應靶點的收集 將“2.3.1”項所得青皮揮發油活性成分錄入TCMSP和PharmMapper數據庫（http：//www.lilab-ecust.cn/pharmmapper/），限定物種為“人類（Homo sapiens）”。將檢索所得各靶點以反向對接結合值（即Fit值）降序排列，選擇前20位作為每個成分對應的主要靶點[32]。將上述主要靶點錄入UniProt數據庫（http：//www.uniprot.org），限定物種為“人類（Homo sapiens）”，檢索相應的UniProt ID，并獲取對應的基因簡稱（Gene symbol），去重后即得青皮揮發油活性成分的對應靶點。

2.3.3 AD相關靶點的收集 以“Alzheimers disease”為關鍵詞，在GeneCards數據庫（https：//www.genecards.org/）、人類孟德爾遺傳數據庫（OMIM，https：//omim.org/）中檢索AD相關靶點。其中，GeneCards數據庫中以相關分數（Relevance score）>10為標準[33]進行篩選。將兩個數據庫的檢索結果去重后，即得AD相關靶點。

2.3.4 青皮揮發油防治AD直接靶點的收集 利用Venny 2.1.0軟件映射“2.3.2”“2.3.3”項下所得青皮揮發油活性成分對應靶點和AD相關靶點，即得青皮揮發油防治AD的直接靶點。

2.3.5 青皮揮發油防治AD作用靶點的確定 為明確青皮揮發油成分靶點與疾病AD靶點之間的相互作用關系，將“2.3.2”“2.3.3”項下所得青皮揮發油活性成分對應靶點和AD相關靶點導入STRING數據庫（https：//string-db.org/），限定物種為“人類（Homo sapiens）”，設置較高置信度（High confidence）≥0.700[34]，除去未相互連接的節點（Node）后，得“靶點互作”網絡并保存為“tsv”格式文件;將上述文件導入Cytoscape 7.2.1軟件，運用軟件中的“CentiScaPe 2.2”插件計算節點度值（Degree），選取度值大于平均度值2倍的靶點作為核心節點（Hub node）[35]。利用Venny 2.1.0軟件將該核心靶點與“2.3.2”“2.3.3”項下所得青皮揮發油活性成分對應靶點和AD相關靶點進行映射，選擇與活性成分對應靶點的交集靶點，在排除與“2.3.4”項下直接靶點重復的靶點之后，即得青皮揮發油防治AD的間接靶點。將直接靶點與間接靶點合并，即得青皮揮發油防治AD作用靶點。

2.3.6 基因本體（GO）功能和KEGG通路富集分析 將“2.3.5”項下所得青皮揮發油防治AD作用靶點錄入DAVID 6.7數據庫（https：//david-d.ncifcrf.gov/summary.jsp），限定物種為“人類（Homo sapiens）”，進行GO功能富集和KEGG通路富集分析，以P<0.05為顯著富集，且P值越小則顯著性程度越高[36]。將P值由小到大排序，取前10位利用GraphGad Prinsm 7軟件繪制GO功能富集柱狀圖（即二級分類柱狀圖，包括細胞組分、分子功能、生物過程）;將P值由小到大排序，利用OmicShare在線工具（http：//www.omicshare.com/）繪制KEGG通路富集氣泡圖。

2.3.7 關鍵成分和關鍵靶點的篩選 將“2.3.5”項下所得青皮揮發油防治AD作用靶點及相應活性成分通過Cytoscape 3.7.1軟件構建青皮揮發油的“活性成分-作用靶點”網絡，并運用軟件中“CentiScaPe 2.2”插件進行拓撲學分析，計算節點度值、介數中心度（Betweenness centrality）和緊密中心度（Closeness centrality），并選擇上述參數均大于其對應均值的成分和靶點作為青皮揮發油抗AD的關鍵成分和關鍵靶點[35]，再通過Cytoscape 3.7.1軟件構建“關鍵成分-關鍵靶點”網絡，進行可視化展示。

3 結果

3.1 青皮揮發油GC-MS分析結果

青皮揮發油GC-MS總離子流圖見圖1。經NIST 11.L質譜數據庫檢索、匹配和人工解析后，共鑒定出40個成分（匹配度均大于80%），大多為萜烯類、不飽和醇類、酯類、長鏈烷烴類以及苯類化合物，如右旋檸檬烯、 γ-萜品烯、芳樟醇、β-月桂烯等，詳見表1。

3.2 青皮揮發油防治AD作用靶點的篩選結果

表1中，所有化學成分的OB值均大于30%;除（-）-4-萜品醇的DL值為0.11外，其余化學成分的DL值均大于0.18。考慮到（-）-4-萜品醇對情志病具有一定的治療作用[37-38]，故本研究將包含其在內的40個化學成分作為活性成分全部導入TCMSP和PharmMapper數據庫，并分別收集到273、760個靶點;經UniProt數據庫校正、去重后得到青皮揮發油活性成分對應靶點151個。以“Alzheimers disease”為關鍵詞，在GeneCards和OMIM數據庫中共收集到AD相關靶點1 291個。經Venny 2.1.0軟件映射后，共得到青皮揮發油防治AD直接靶點48個。

利用STRING數據庫和Cytospace 3.7.1軟件共篩選出大于平均度值（21.866）2倍的核心節點401個（“靶點互作”網絡圖略）;經Venny 2.1.0軟件映射后，共得到間接靶點41個。將直接靶點和間接靶點合并，即得青皮揮發油防治AD作用靶點89個，詳見圖2。

3.3 GO功能富集和KEGG通路富集結果

GO功能富集結果顯示，89個作用靶點主要涉及GO功能過程564個（P<0.05）。其中，生物過程富集440個，以有機物的反應（Response to organic substance）、對內生刺激的反應（Response to endogenous stimulus）、細胞內信號級聯（Intracellular signaling cascade）等為主;細胞組分富集43個，以細胞分數（Cell fraction）、軸突（Axon）、胞漿（Cytosol）、不溶性組分（Insoluble fraction）等為主;分子功能富集81個，以胺受體活性（Amine receptor activity）、蛋白激酶活性（Protein kinase activity）、胺結合（Amine binding）、腎上腺素受體活性（Adrenoceptor activity）等為主，詳見圖3。

KEGG通路富集結果顯示，89個作用靶點主要富集于19條通路上（P<0.05），以癌癥通路（Pathways in cancer）、局灶性粘連（Focal adhesion）、結直腸癌（Colorectal cancer）、鈣信號通路（Calcium signaling pathway）、神經營養素信號通路（Neurotrophin signaling pathway）等為主，詳見圖4。

3.4 青皮揮發油防治AD關鍵成分及關鍵靶點的篩選結果

“活性成分-作用靶點”網絡（圖略）中，介數中心度、緊密中心度和節點度值均大于其對應平均值（上述參數的平均值分別為456.201 7、0.003 130、14.900）的關鍵成分有10個，分別為α-萜品烯、β-elemen、百里酚、（-）-4-萜品醇、右旋檸檬烯、乙酸橙花酯、香葉醇、Cis-2，8-menthadien-1-ol、β-松油醇、Cis-carveol，節點度值分別為31.000、27.000、26.000、25.000、21.000、19.000、19.000、17.000、17.000、17.000。其中，α-萜品烯、β-elemen、百里酚、（-）-4-萜品醇的節點度遠高于其他成分。

介數中心度、緊密中心度和節點度值均大于其對應平均值（上述參數的平均值分別為134.561 8、0.002 679、6.700）的關鍵靶點有21個，分別為血清白蛋白（ALB）、載脂蛋白A-Ⅱ（APOA2）、胱天蛋白酶7（CASP7）、碳酸酐酶2（CA2）、維生素D結合蛋白（GC）、類驅動蛋白KIF11（KIF11）、骨形態發生蛋白2（BMP2）、β-分泌酶1（BACE1）、鈉依賴性多巴胺轉運體（SLC6A3）、雄激素受體（AR）、前列腺素G/H合酶2（PTGS2）、絲裂原活化蛋白激酶14（MAPK14）、凝血酶原（F2）、毒蕈堿乙酰膽堿受體M1（CHRM1）、γ-氨基丁酸受體α-2亞單位（GABRA2）、CHRM2、二肽基肽酶4（DPP4）、絲裂原活化蛋白激酶10（MAPK10）、孕酮受體（PGR）、MAPK8、CHRM3，節點度值分別為34.000、27.000、24.000、22.000、21.000、21.000、20.000、17.000、16.000、16.000、16.000、15.000、14.000、14.000、13.000、13.000、12.000、12.000、10.000、10.000、9.000。其中，AR、PTGS2、MAPK14、CHRM1、CHRM2、MAPK10、PGR、MAPK8、CHRM3富集于“3.3”項下所得的19條KEGG通路上。青皮揮發油防治AD的“關鍵成分-關鍵靶點”網絡見圖5。

4 討論

本研究結合GC-MS技術與網絡藥理學方法，初步探討了青皮揮發油防治AD的潛在活性成分以及分子作用機制。通過GC-MS分析，共鑒定出匹配度較高的活性成分40個;通過TCMSP、PharmMapper數據庫和軟件映射后，共得到青皮揮發油防治AD作用靶點89個。

GO富集結果顯示，89個作用靶點主要分布于564個GO功能過程。筆者結合AD的發病機制分析發現，蛋白激酶可通過抑制Tau蛋白的過度磷酸化而保護神經元[39];突觸的胞外信號可引起胞內信號級聯，并參與調節基因功能[40]，均與AD發生有關。本研究GO富集結果顯示，89個作用靶點主要富集于蛋白激酶活性、細胞內信號級聯等生物過程及分子功能，與上述研究基本一致，提示青皮揮發油可能通過上述途徑防治AD。有研究指出，鈣離子濃度過高，可激活蛋白激酶，從而引起Tau蛋白的過度磷酸化;鈣離子濃度過低，則會導致依賴鈣的相關酶活性降低，造成β淀粉樣蛋白（Aβ）沉積[41];鈣離子失調還會引起活性氧等下游物質含量升高，誘發體內氧化應激，最終導致神經元凋亡[42-43]。神經營養素是神經營養物質，也是與神經細胞存活相關的生長因子，其家族成員之一的腦源性神經營養因子主要分布于大腦中樞神經系統，與學習以及記憶能力密切相關[44-45]。此外，徐倩等[27]通過生物信息學分析發現，AD的差異表達基因主要富集于癌癥通路，還涉及結直腸癌、非小細胞肺癌等通路。本研究KEGG富集結果顯示，89個作用靶點主要富集于鈣信號通路、神經營養素信號通路以及癌癥通路等信號通路上，提示青皮揮發油可能通過上述通路發揮對AD的防治作用。此外，局灶性粘連、結直腸癌等癌癥通路也可作為青皮揮發油防治AD的潛在靶點，但具體機制有待后續深入研究。

通過對“活性成分-作用靶點”網絡進行拓撲學分析，共篩選出關鍵成分10個。在篩選出的10個關鍵成分中，右旋檸檬烯是青皮揮發油測定結果中峰面積最大的活性成分，且匹配度達99%;γ-萜品烯作為青皮揮發油測定結果中峰面積第二大的成分，有研究指出其與百里酚聯用后可增強乙酰膽堿水平及煙堿型乙酰膽堿的反應性[46]。α-萜品烯為“活性成分-作用靶點”網絡中節點度值最高的成分，具有很好的抗氧化活性，并可有效抑制脂氧合酶和乙酰膽堿酯酶的活性[47]。有研究指出，百里酚對Aβ致海馬突觸損傷的高脂模型大鼠具有一定的保護和治療作用[48-49]。（-）-4-萜品醇可通過抑制丁酰膽堿酯酶的活性來發揮對AD的治療作用[37];且有研究顯示，富含（-）-4-萜品醇的朝鮮冷杉揮發油可有效提高莨菪堿誘導的健忘模型大鼠的記憶力[38]。由此可見，青皮揮發油在防治AD方面具有較好的物質基礎。

通過對“活性成分-作用靶點”網絡進行拓撲學分析，共篩選出關鍵靶點21個。目前，AD的發病機理雖未完全明確，但現代醫學普遍認為，AD的發生與Aβ沉積、Tau蛋白過度磷酸化、炎癥反應、膽堿能、物質能量代謝等因素有關[50-51]。在篩選出的21個關鍵靶點中，ALB的節點度值最高，亦遠高于其余節點。有研究發現，ALB可有效抑制Aβ的聚集，從而緩解AD癥狀[52]。本研究還發現，AR、PTGS2、MAPK14、CHRM1、CHRM2、MAPK10、PGR、MAPK8、CHRM3等9個作用靶點富集于19條KEGG通路上。CHR廣泛存在于大腦中，其中CHRM1可緩解Aβ所致的興奮性神經毒性，并緩解AD模型小鼠的認知障礙[53-54];CHRM2與智力、人格特征以及抑郁等有關[55]，均是AD治療的潛在靶點。MAPK14與炎癥反應的發生密切相關，且其表達量在AD模型大鼠體內明顯升高[56]，亦可能成為治療AD的作用靶點之一。PTGS2已被初步證實為杜仲植物雌激素類成分治療AD[57]以及酸棗仁湯治療失眠[58]的主要靶點之一。孕酮是一種重要的內源性神經元載體，不僅對生殖系統具有重要意義，而且還可通過提高神經元存活率、抑制炎癥反應、改善腦缺血和腦損傷等途徑調節神經系統功能[59-60]，但關于孕酮及其受體發揮神經保護作用的機制尚不完全清楚，有待后續研究予以證實。

綜上所述，本研究借助GC-MS技術和網絡藥理學方法，初步篩選了青皮揮發油防治AD的活性成分及潛在作用靶點，為中藥揮發油防治AD等情志類疾病的研究以及后續實驗評價指標的篩選等提供了思路與理論依據。

參考文獻

[ 1 ] 國家藥典委員會.中華人民共和國藥典：一部[S]. 2015年版.北京：中國醫藥科技出版社，2015：197.

[ 2 ] 靳貝貝，裴香萍，梁惠珍.青皮藥材的HPLC指紋圖譜建立及聚類分析和主成分分析[J].中國藥房，2018，29（24）：3336-3339.

[ 3 ] 馮永輝，馮娟.淺談陳皮常見藥對的配伍應用[J].陜西中醫，2011，32（7）：906-907.

[ 4 ] 陳紅，劉傳玉，李承晏.青皮的化學及藥理作用研究進展[J].中草藥，2001，32（11）：1051-1052.

[ 5 ] 劉恒，馬永明，瞿頌義，等.青皮對大鼠離體子宮平滑肌運動的影響[J].中草藥，2000，31（3）：203-205.

[ 6 ] 陳青，鐘宏波.黔產青皮揮發油化學成分及抑菌活性研究[J].中國實驗方劑學雜志，2011，17（9）：118-121.

[ 7 ] 高順平，鄔國棟，劉全禮.青皮的研究進展[J].包頭醫學院學報，2014，30（1）：139-141.

[ 8 ] 徐小娜，蔣軍輝，王永生，等. GC-MS和HELP法分析藥對陳皮-青皮與其單味藥揮發油成分[J].分析測試學報，2012，31（10）：1277-1281.

[ 9 ] TIRADO CB，STASHENKO EE，COMBARIZA MY，et al. Comparative study of Colombian citrus oils by high-resolution gas chromatography and gas chromatography-mass spectrometry[J]. J Chromatogr A，1995，697（1）：501-513.

[10] FLAMINI G，TEBANO M，CIONI PL. Volatiles emission patterns of different plant organs and pollen of Citrus limon[J]. Anal Chim Acta，2007，589（1）：120-124.

[11] WANG Y，YI L，LIANG Y，et al. Comparative analysis of essential oil components in Pericarpium Citri Reticulatae Viride and Pericarpium Citri Reticulatae by GC-MS combined with chemometric resolution method[J]. J Pharm Biomed Anal，2008，46（1）：66-74.

[12] KANG SA，PARK HJ，KIM M，et al. Citri Reticulatae Viride Pericarpium extract induced apoptosis in SNU-C4 human colon cancer cells[J]. J Ethnopharmacol，2005，97（2）：231-235.

[13] ASAMOTO M，TORIYAMA-BABA H，OHNISHI T，et al. Transgenic rats carrying human c-Ha-ras proto-oncogene are highly susceptible to N-nitrosomethylbenzy- lamine induction of esophageal tumorigenesis[J]. Jpn J Cancer Res，2002，93（7）：744-751.

[14] BEZERRA DP，COSTA EV，NOGUEIRA PCL. Essential oil constituents：biodiversity and their applicability for cancer therapy[M]. Berlin：Springer-Verlag，2013：285- 300.

[15] DAO TP，TRAN TH，NGUYEN PTN，et al. Chemical composition and evaluation of antibacterial activities of essential oil from lemon （Citrus aurantifolia L.） leaves growing Tien Giang Province，Vietnam [J]. Asian J Chem，2019，31（10）：2284-2286.

[16] COSENTINO S，TUBEROSO CIG，PISANO B，et al. In- vitro antimicrobial activity and chemical composition of Sardinian Thymus essential oils[J]. Lett Appl Micro Biol，1999，29（2）：130-135.

[17] 黃龍艦，趙春陽，馮新紅，等.抗阿爾茨海默病藥物非臨床藥效學評價體系的探索[J].藥學學報，2020，55（5）：789-805.

[18] 李慧婷，李遠輝，任桂林，等.中藥揮發油防治情志疾病的研究現狀及前景展望[J].中草藥，2019，50（17）：4031- 4040.

[19] 李艷萍，李海燕，紀曉婉，等.金釵石斛葉中總黃酮的提取分離及體外抗阿爾茨海默病活性研究[J].中國藥房，2018，29（3）：330-333.

[20] 鄭家歡.藥用植物揮發油的提取及抗抑郁活性研究[D].廣州：廣東藥科大學，2017.

[21] 馮波，靖慧軍，郭敏娟，等.石菖蒲揮發油和水煎液的抗焦慮作用[J].中國實驗方劑學雜志，2014，20（9）：207-210.

[22] 賀利敏.自閉癥小鼠神經行為學觀察及辛夷揮發油對其學習記憶行為影響研究[D].合肥：安徽醫科大學，2016.

[23] 齊越，劉冉，賈冬，等.溫郁金揮發油對Aβ25-35致阿爾茲海默病小鼠模型行為學的影響[J].實驗動物科學，2017，34（5）：23-27.

[24] 王虎平，吳紅彥，李海龍，等.當歸有效組分防治阿爾茨海默病模型大鼠組方配伍優化的實驗研究[J].甘肅中醫藥大學學報，2019，36（3）：12-19.

[25] 劉根.運用數據挖掘方法對益智抗老年性癡呆類方劑核心藥物組合的篩選研究[D].太原：山西中醫學院，2016.

[26] 顧彥琳.加味癲狂夢醒湯治療阿爾茨海默病痰瘀互結證臨床療效的觀察[D].長沙：湖南中醫藥大學，2019.

[27] 徐倩，蘇湲淇，譚毅，等.阿爾茨海默病相關差異表達基因及其生物信息學分析[J].中國藥房，2019，30（24）：3423-3427.

[28] 趙杰，許波，劉金豹，等.基于網絡藥理學探討牛膝治療骨質疏松的潛在有效成分及作用機制[J].中國藥房，2019，30（22）：3090-3095.

[29] 劉丹凱，王凱，魏賑權，等.昆明山海棠-雞血藤藥對治療類風濕關節炎作用機制的網絡藥理學研究[J].中國藥房，2019，30（19）：2639-2644.

[30] 劉樹森，孫文斌，李文蘭，等.基于網絡藥理學的黃連-吳茱萸藥對抗癌及治療心腦血管疾病機制研究[J].中草藥，2020，51（1）：109-117.

[31] 孫曉麗，楊若聰，劉俊杰，等.基于網絡藥理學研究龍生蛭膠囊抗腦卒中的作用機制[J].中華中醫藥雜志，2019，34（5）：2165-2168.

[32] ZHUANG Y，QIN K，YANG B，et al. Prediction of the targets of the main components in blood after oral administration of Xanthii Fructus：a network pharmacology study[J]. RSC Advances，2018，8（16）：8870-8877.

[33] 逯克娜，林寒梅，黃巍，等.基于網絡藥理學的化痰通脈飲“半夏-當歸”藥對抗多囊卵巢綜合征作用機制的研究[J].時珍國醫國藥，2019，30（3）：539-543.

[34] ZHU J，YI X，ZHANG Y，et al. Systems pharmacology- based approach to comparatively study the independent and synergistic mechanisms of danhong injection and naoxintong capsule in ischemic stroke treatment[J]. Evid- Based Complement Altern，2019. DOI：10.1155/2019/1056708.

[35] 伊曉嬌.基于系統生物學方法的丹紅注射液抗阿霉素心肌毒性作用機制研究[D].杭州：浙江大學，2019.

[36] 甘東浩，陳德強，馮蓬，等.基于網絡藥理學探討骨碎補抗骨質疏松的物質基礎及作用機制[J].中國實驗方劑學雜志，2019，25（13）：186-191.

[37] BONESI M，MENICHINI F，TUNDIS R，et al. Acetylcholinesterase and butyrylcholinesterase inhibitory activity of Pinus species essential oils and their constituents[J]. J Enzym Inhib Med Chem，2010，25（5）：622-628.

[38] KIM K，BU Y，JEONG S，et al. Memory-enhancing effect of a supercritical carbon dioxide fluid extract of the needles of Abies koreana on scopolamine-induced amnesia in mice[J]. Biosci Biotech Biochem，2006，70（8）：1821- 1826.

[39] MOHANDAS E，RAJMOHAN V，RAGHUNATH B. Neurobiology of Alzheimers disease[J]. Indian J Psychiatry，2009，51（1）：55-61.

[40] ARPITA K，ASHISH K，BRYAN M，et al. A serine protea- se KLK8 emerges as a regulator of regulators in memory：microtubule protein dependent neuronal morphology and PKA-CREB signaling[J]. Sci Rep，2018. DOI：10. 1038/s41598-018-27640-6.

[41] 汪亞楠，李思齊，岳一強，等.基于網絡藥理學的苓桂術甘湯治療阿爾茨海默病的潛在作用機制研究[J].中草藥，2019，50（23）：5812-5122.

[42] WATER BVD，ZOETEWEIJ JP，BONT HJD，et al. Role of mitochondrial Ca2+ in the oxidative stress-induced dissipation of the mitochondrial membrane potential：studies in isolated proximal tubular cells using the nephrotoxin 1，2-dichlorovinyl-L-cysteine[J]. J Biol Chem，1994，269（20）：14546-14552.

[43] 胡倩，劉育鋮，毛思宇，等.基于網絡藥理學對白術治療阿爾茨海默癥的機制探討[J].中南藥學，2020，18（3）：427-434.

[44] 劉邵陽，白辰，徐競男，等.基于網絡藥理學方法探索達原飲治療發熱作用機制[J].中國中醫藥信息雜志，2020，27（5）：84-89.

[45] 郁俊昌，唐牟尼，韓海英，等.阿爾茨海默病、血管性癡呆及輕度認知障礙患者血漿腦源性神經營養因子濃度變化[J].實用醫學雜志，2013，29（9）：1429-1431.

[46] SAMMI SR，TRIVEDI S，RATH SK，et al. 1-methyl-4- propan-2-ylbenzene from Thymus vulgaris attenuates cholinergic dysfunction[J]. Mol Neurobiol，2016，54（7）：5468-5481.

[47] CUTILLAS AB，CARRASCO A，MARTINEZ-GUTIERREZ R，et al. Thymus mastichina L. essential oils from Murcia （Spain）：composition and antioxidant，antienzymatic and antimicrobial bioactivities[J]. PLoS One，2018. DOI：10.1371/journal.pone.0190790.

[48] ASADBEGI M，YAGHMAEI P，SALEHI I，et al. Investigation of thymol effect on learning and memory impairment induced by intrahippocampal injection of amyloid beta peptide in high fat diet-fed rats[J]. Metab Brain Dis，2017，32（3）：827-839.

[49] ASADBEGI M，KOMAKI A，SALEHI I，et al. Effects of thymol on amyloid-β-induced impairments in hippocampal synaptic plasticity in rats fed a high-fat diet[J]. Brain Res Bull，2018. DOI：10.1016/j.brainresbull.2018.01.008.

[50] 王濤.阿爾茨海默癥Ch4腦區相關的遺傳變異位點的識別與分析[D].哈爾濱：哈爾濱工業大學，2019.

[51] 羅俊.石菖蒲-益智仁精油提取工藝及精油吸嗅給藥對AD的作用研究[D].南昌：江西中醫藥大學，2019.

[52] XIE B，LI X，DONG XY，et al. Insight into the inhibition effect of acidulated serum albumin on amyloid β-protein fibrillogenesis and cytotoxicity[J]. Langmuir，2014，30（32）：9789-9796.

[53] GU Z，ZHONG P，YAN Z. Activation of muscarinic receptors inhibits beta-amyloid peptide-induced signaling in cortical slices[J]. J Biol Chem，2003，278（19）：17546- 17556.

[54] 畢丹蕾，文朗，熊偉，等.阿爾茨海默病的可能藥物靶點和臨床治療研究進展[J].中國藥理學與毒理學雜志，2015，29（4）：507-536.

[55] CHEE LY，CUMMING A. Polymorphisms in the cholinergic receptors muscarinic （CHRM2 and CHRM3） genes and Alzheimers disease[J]. Avicenna J Med Biotechnol，2018，10（3）：196-199.

[56] QILING JI，XUEMEI WANG，CAI J. MiR-22-3p regulates amyloid β deposit in mice model of Alzheimers disease by targeting mitogen-activated protein kinase 14[J]. Curr Neurovasc Res，2019，16（5）：473-480.

[57] 王晶，劉斌，薛慧，等.基于整合藥理學平臺的杜仲植物雌激素類成分治療AD的作用機制研究[J].現代中藥研究與實踐，2019，33（1）：30-34.

[58] 鄺梓君，湯順莉，黃雁，等.酸棗仁湯治療失眠的有效成分預測與靶點通路分析[J].中華中醫藥雜志，2018，33（8）：3585-3590.

[59] 秦亞彬.孕酮對Aβ所致神經元損傷的保護作用及其機制研究[D].石家莊：河北醫科大學，2015.

[60] 孫爽.孕酮對AD細胞模型及動物模型神經再生的影響及機制研究[D].石家莊：河北醫科大學，2018.

（收稿日期：2020-02-07 修回日期：2020-07-07）

（編輯：張元媛）