浙貝母UPLC-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜的建立及其抗炎質量標志物的分析

程斌 周愛珍 彭昕 王昕蕾 王娟

摘 要 目的：建立浙貝母超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜（UPLC-Q-TOF-MS/MS）指紋圖譜，并確定其抗炎質量標志物。方法：色譜柱為Eclipse Plus C18，流動相為甲醇-0.1%甲酸水溶液（梯度洗脫），流速為0.4 mL/min，柱溫為30 ℃，進樣量為2 ?L;采用電噴霧離子源，以正、負離子模式檢測，在質荷比（m/z）50～1 200范圍內進行掃描。采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004A版）建立10批不同產地浙貝母的UPLC-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜。以小鼠耳腫脹度和血清中丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）水平為抗炎指標，采用雙變量相關分析法和灰色關聯度分析法對浙貝母指紋圖譜中各共有峰相對峰面積與抗炎指標的相關性進行分析，篩選質量標志物并進行結構鑒定。結果：在正、負離子模式下，10批浙貝母藥材分別各有共有峰26、10個。綜合雙變量相關分析和灰色關聯度分析結果，共發現與抗炎作用相關的質量標志物9個，經鑒定分別為貝母素乙、貝母素甲、環巴胺、胡蘿卜苷、Polyphyllin Ⅴ、苦鬼臼毒素、植物甾醇、Ent-kaur-15-en-17-ol、Ent-17-norkauran-16-one。結論：所建立的UPLC-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜可用于評價浙貝母藥材的質量;貝母素乙、貝母素甲、環巴胺等可能是浙貝母具有抗炎作用的質量標志物。

關鍵詞 浙貝母;抗炎作用;超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜;雙變量相關分析;灰色關聯度分析;質量標志物

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish UPLC-Q-TOF-MS/MS fingerprint of Fritillaria thunbergii， and to define its anti-inflammatory quality markers. METHODS： The determination was performed on Eclipse Plus C18 column with mobile phase consisted of methanol-0.1% formic acid solution （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was set at 30 ℃， and injection volume was 2 ?L. The electrospray ion source was used to scan in the range of m/z 50-1 200 with positive and negative ion detection mode. UPLC-Q-TOF-MS/MS fingerprints of 10 batches of F. thunbergii from different habitats were established by using the Similarity Evaluation System of TCM Chromatographic Fingerprints （2004A edition）. With ear swelling degree， the serum levels of MDA and NO as anti-inflammatory indexes， the correlation between the relative area of common peaks in fingerprint and the anti-inflammatory indexes was analyzed by using bivariate correlation analysis and grey correlation analysis， and the quality markers were screened and identified. RESULTS： In positive and negative ion mode， 10 batches of F. thunbergii had 26 peaks and 10 peaks. Based on bivariate correlation analysis and grey correlation analysis， nine quality markers related to anti-inflammatory effect were found， which were identified as peiminine， peimine， cyclobalamine， daucidin， polyphyllin Ⅴ， bitumen podophyllotoxin， phytosterol， ent-kaur-15-en-17-ol， ent-17-norkauran-16-one. CONCLUSIONS： Established UPLC-Q- TOF-MS/MS fingerprint can be used to evaluate the quality of F. thunbergii; peiminine， peimine and cyclobalamine and so on may be the quality markers of anti-inflammatory effect of F. thunbergii.

KEYWORDS? ?Fritillaria thunbergii; Anti-inflammatory effect; UPLC-Q-TOF-MS/MS; Bivariate correlation analysis; Grey correlation analysis; Quality markers

浙貝母是百合科植物浙貝母（Fritillaria thunbergii Miq.）的干燥鱗莖，具有清熱、化痰、止咳、解毒、散結、消癰等功效，主治風熱犯肺、痰火咳嗽、肺癰、乳癰、瘰疬和瘡毒等癥[1]。近年來研究表明，浙貝母的化痰、止咳、松弛氣管平滑肌、抗炎等作用是其治療呼吸系統疾病的藥理學基礎[2]，其中浙貝母化痰、止咳的活性成分已較為明確，但對其抗炎活性成分的研究相對較少，主要集中在生物堿類成分貝母素甲和貝母素乙[3-5]。

質量標志物是2016年提出的中藥質量評價新概念，即通過一系列篩選和驗證研究，確定與該藥物目標活性相關的成分，作為反映其安全性和有效性的標志性物質進行質量控制[6-7]。中藥譜-效研究是篩選中藥質量標志物的重要方法和技術之一，即先將化學指紋圖譜中有用的化學信息提取出來，然后與藥效實驗結果相結合，通過線性或非線性數學處理，建立譜-效數學模型，從而確定與藥效相關的化合物[8]。本研究采用超高效液相色譜-四極桿-飛行時間串聯質譜法（UPLC-Q-TOF-MS/MS）建立10批不同產地浙貝母的指紋圖譜;以小鼠耳腫脹度和血清中丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）水平為藥效指標，采用雙變量相關分析法和灰色關聯度分析法對UPLC-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜中各共有峰與抗炎藥效指標的相關性進行分析，從而篩選出質量標志物并進行鑒定，以期初步揭示浙貝母具有抗炎作用的藥效物質基礎，為其質量控制和資源開發提供參考。

1 材料

1.1 儀器

Acquity型UPLC色譜儀、PGA495型MS儀（美國Waters公司）;125D-1CN型十萬分之一電子分析天平（德國Sartorius公司）;VS10-300C型超聲波清洗器（無錫沃信儀器制造有限公司）;HH-W420型電熱恒溫水浴鍋（濟南歐萊博科學儀器有限公司）;UV-5200PC型紫外可見分光光度計（上海力申科學儀器有限公司）;HBS-1096A型酶標儀（南京德鐵實驗設備有限公司）;FrontierTM 5000型微量高速離心機（美國Ohaus公司）。

1.2 藥品與試劑

西貝素、貝母辛、貝母素甲、貝母素乙對照品（上海源葉生物科技有限公司，批號：B21331、B20082、B20080、B20081，純度均大于99.0%）; MDA、NO酶聯免疫吸附試驗（ELISA）檢測試劑盒（南京建成生物工程研究所，批號：20190203、20190119）;地塞米松片（遂成藥業股份有限公司，批號：180803，規格：0.75 mg）;甲醇、乙腈為色譜純，甲酸為質譜級，水為純凈水。浙貝母藥材購于浙江磐安藥材市場，經浙江醫藥高等專科學校中藥學院楊雄志教授鑒定為百合科植物浙貝母（F. thunbergii Miq.）的干燥鱗莖，藥材信息詳見表1。

1.3 動物

潔凈級ICR小鼠，雌雄各半，體質量（20±2） g，購于長春市億斯實驗動物技術有限責任公司，動物生產許可證號：SCXK（吉）2018-0007。

2 方法與結果

2.1 色譜與質譜條件

色譜條件：色譜柱為Agilent Zorbax HPLC Eclipse Plus C18（150 mm×3 mm，1.8 μm）;流動相為乙腈（A）- 0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脫（0～5 min，2%A→25%A;5～10 min，25%A→45%A;10～15 min，45%A→80%A;15～25 min，80%A→100%A;25～30 min，100%A;30～33 min，100%A→2%A）;流速為0.4 mL/min;柱溫為30 ℃;進樣量為2 ?L。

質譜條件：電噴霧離子源，V模式，電壓為3.0 kV，離子源溫度為100 ℃，去溶劑氣溫度為400 ℃;正、負離子掃描模式，掃描范圍為質荷比（m/z）50～1 200;去溶劑氣流速為800 L/h。

2.2 供試品溶液的制備

取浙貝母藥材適量，粉碎，過四號篩（下同），取其粉末2 g，加入濃氨水溶液4 mL，浸潤1 h，加入三氯甲烷-甲醇（4 ∶ 1，V/V）40 mL，混勻，稱定質量，于80 ℃水浴加熱回流2 h，放冷，補足減失的質量，過濾;取續濾液10 mL，于98～100 ℃水浴條件下蒸干，殘渣以甲醇溶解并定容于2 mL 量瓶中，即得供試品溶液。

2.3 方法學考察

本研究在正、負離子掃描模式下均進行方法學考察。

2.3.1 精密度試驗 取浙貝母藥材（編號：S1）粉末2 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜與質譜條件連續進樣5次。在正、負離子掃描模式下，分別以6號峰（貝母素甲）、5號峰（浙貝素）的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，在正離子掃描模式下，26個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.40%（n=5）;在負離子掃描模式下，10個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.80%（n=5），詳見表2、表3。這表明本方法精密度良好。

2.3.2 重復性試驗 取浙貝母藥材（編號：S1）粉末2 g，共5份，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析。在正、負離子掃描模式下，分別以6號峰（貝母素甲）、5號峰（浙貝素）的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，在正離子掃描模式下，26個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.00%（n=5）;在負離子掃描模式下，10個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.70%（n=5），詳見表2、表3。這表明本方法重復性良好。

2.3.3 穩定性試驗 取浙貝母藥材（編號：S1）粉末2 g，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫下放置0、2、4、6、12、24 h后，按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析。在正、負離子掃描模式下，分別以6號峰（貝母素甲）、5號峰（浙貝素）的保留時間和峰面積為參照，記錄各共有峰的相對保留時間和相對峰面積。結果，在正離子掃描模式下，26個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于2.90%（n=5）;在負離子掃描模式下，10個共有峰相對保留時間和相對峰面積的RSD均小于3.00%（n=5），詳見表2、表3。這表明供試品溶液于室溫下放置24 h內穩定性良好。

2.4 浙貝母UPLC-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜的生成及相似度分析

2.4.1 指紋圖譜的生成 取10批浙貝母藥材樣品粉末，按“2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜與質譜條件進樣分析，分別在正、負離子掃描模式下采集圖譜，然后將圖譜文件導入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004A版），以中位數法生成UPLC-Q- TOF-MS/MS指紋圖譜。結果，在正、負離子模式下，10批浙貝母藥材分別各有共有峰26、10個，詳見圖1。

2.4.2 相似度分析 采用《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統》（2004A版）進行相似度評價，按照相關步驟進行色譜峰的匹配及對照圖譜（R）的生成。以對照圖譜為參照圖譜，將10批浙貝母指紋圖譜分別與其進行比較，并計算相似度值。結果，在正、負離子模式下，10批浙貝母藥材的相似度均分別大于0.840、0.810，表明不同產地浙貝母藥材中所含化學成分有一定的差異，詳見表4。

2.5 浙貝母的抗炎作用考察

2.5.1 分組、造模與給藥 將小鼠分為模型組（生理鹽水）、陽性對照組（地塞米松，0.000 4 g/kg，根據人與小鼠等效劑量系數換算）和10批浙貝母高、低劑量組（1.3、0.325 g/kg，均以生藥量計，根據人與小鼠等效劑量系數換算，其中高劑量為臨床等效劑量的2倍），共22組，每組10只，每天灌胃給藥1次（臨用時均用水制成相應藥液），連續給藥7 d。末次灌胃給藥30 min后，取20 ?L二甲苯涂布于各組小鼠右耳的前后兩面以復制炎癥模型，并以其左耳作為空白對照，涂布生理鹽水。

2.5.2 小鼠血清中MDA、NO水平檢測 造模1 h后，各組小鼠摘眼球取血，以3 500 r/min離心后取上層血清，根據相應試劑盒說明書操作，檢測血清中MDA、NO的水平。結果，與模型組比較，陽性對照組和10批浙貝母高、低劑量組小鼠血清中MDA水平均顯著升高，NO水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01），詳見表5。

2.5.3 小鼠耳腫脹度的檢測 參考相關文獻方法[9]，將各組小鼠脫頸處死，用直徑為9 mm的打孔器在小鼠左、右耳對稱部位打下圓耳片，稱定質量，并計算耳腫脹度（耳腫脹度=右圓耳片質量-左圓耳片質量）。結果，與模型組比較，陽性對照組和10批浙貝母高、低劑量組小鼠耳腫脹度均顯著減少（P<0.05或P<0.01），詳見表5。

2.6 浙貝母譜-效相關性分析

2.6.1 雙變量相關分析 參考相關文獻方法[10]，以均值化后的10批浙貝母指紋圖譜的共有峰相對峰面積為因變量，抗炎指標小鼠耳腫脹度和血清MDA、NO水平為自變量，采用SPSS 19.0軟件進行雙變量相關分析，計算各變量與共有峰相對峰面積的相關系數。當相關系數絕對值大于0.6時，表示顯著相關;當該值大于0.7時，表示極顯著相關。結果，在正離子模式下，12、21號峰相對峰面積與耳腫脹度顯著相關，5、6、7、9、11、17號峰相對峰面積與NO水平顯著相關，12、14號峰相對峰面積與NO水平極顯著相關;負離子模式下沒有色譜峰與抗炎指標呈顯著相關，詳見表6、表7。

2.6.2 灰色關聯度分析 以10批浙貝母指紋圖譜共有峰的相對峰面積為子序列，以小鼠耳腫脹度和血清中MDA、NO水平為母序列，進行灰色關聯度分析。當關聯度>0.5時，認為子序列與母序列之間有著一定的關聯性，且關聯度數值越高，說明關聯性越強[11]。結果，在正離子模式下，1、3、4、5、6、7、9、10、11、12、14、17、20、21、24、26號峰與耳腫脹度和MDA、NO水平均相關;在負離子模式下，3、5號峰與耳腫脹度和MDA、NO水平均相關，詳見表8、表9。

綜合雙變量相關分析和灰關聯度分析結果可知，與抗炎指標相關的共有峰分別為5、6、7、9、11、12、14、17、21號峰，初步推測這9個峰所對應的化合物為浙貝母抗炎作用的質量標志物。

2.7 浙貝母抗炎質量標志物的化學成分鑒定

通過查閱相關文獻[12-18]，構建浙貝母化學成分的數據集，包括化學成分、英文名稱、分子式、結構以及化學物質登錄號等。利用Waters Masslynx 4.1軟件，對“2.6”項下篩選出的與抗炎作用相關的9個共有峰進行成分結構表征。方法參數設置如下：保留時間范圍為0～33 min，保留時間誤差限為0.01 min，質量誤差限為0.01 Da，質量精確度小于10 ppm。將各共有峰的峰強度、保留時間和m/z等信息與對照品進行比較，同時結合化合物的一、二級質譜信息和裂解規律，參考文獻資料進行分析，結果詳見表10。

由表10可知，浙貝母質量標志物為貝母素乙、貝母素甲、環巴胺、胡蘿卜苷、Polyphyllin Ⅴ、苦鬼臼毒素、植物甾醇、Ent-kaur-15-en-17-ol、Ent-17-norkauran-16-one。

3 討論

UPLC-Q-TOF-MS/MS法將液相色譜的高分離效能與質譜的強大結構鑒定功能相結合，故在中藥化學成分分析、中藥質量控制等研究中得到廣泛應用。本研究采用UPLC-Q-TOF-MS/MS技術建立了10批不同產地浙貝母藥材的指紋圖譜。在試驗前期，筆者考察了色譜分析的條件后發現，利用乙腈-0.1%甲酸水溶液梯度洗脫的分離效果優于甲醇-水溶液，且色譜圖中各峰峰形穩定、分離度良好。

地塞米松是一種人工合成的皮質類固醇，屬于腎上腺皮質激素類藥，可抑制炎癥部位中白細胞和巨噬細胞的聚集，減弱兩者的吞噬作用，并對溶酶體酶以及炎癥介質的合成和釋放起到抑制作用，能夠減輕和防止炎癥反應，從而達到減輕炎癥的效果[19]，故在浙貝母抗炎作用實驗中將其作為陽性對照。

本研究選用二甲苯對小鼠耳廓進行造模，可迅速引起小鼠耳血管內液向組織液滲出，導致耳腫脹，產生炎癥[20]。炎癥狀態下，MDA 是氧自由基與細胞膜上不飽和脂肪酸發生脂質過氧化反應的產物，可間接反映血漿中氧自由基的水平，且其水平與抗炎效果呈正相關;NO 由內源性一氧化氮合酶（NOS）催化 L-精氨酸生成，NOS主要分布于巨噬細胞、內皮細胞、血管平滑肌細胞中，在炎癥狀態下大量產生，繼而催化產生大量 NO，加重炎癥反應[21]。本研究結果顯示，不同產地浙貝母藥材均具有良好的抗炎作用。

雙變量相關分析是研究2個或2個以上隨機變量間相關關系的統計分析方法[22]，本研究將中藥指紋圖譜中各色譜峰看作為一個變量，各抗炎指標也可看作一個變量，分析兩者之間的相關程度。灰色關聯度分析適用于系統信息量較少而涉及因素多的圖譜，有利于體現各成分間的相互作用，同時關聯系數可反映2個被比較序列的緊密程度[23-24]。本研究綜合雙變量相關分析和灰關聯度分析的結果，推測出與抗炎作用相關的共有峰有9個，經鑒定分析確定為貝母素乙（5號峰）、貝母素甲（6號峰）、環巴胺（7號峰）、胡蘿卜苷（9號峰）、Polyphyllin Ⅴ（11號峰）、苦鬼臼毒素（12號峰）、植物甾醇（14號峰）、Ent-kaur-15-en-17-ol（17號峰）、Ent-17-norkauran-16-one（21號峰）。

綜上所述，本研究建立了不同產地浙貝母的UPLC-Q-TOF-MS/MS指紋圖譜，并初步推測貝母素乙、貝母素甲、環巴胺、胡蘿卜苷、Polyphyllin Ⅴ、苦鬼臼毒素、植物甾醇、Ent-kaur-15-en-17-ol、Ent-17-norkauran- 16-one是其具有抗炎作用的質量標志物，這可為后續浙貝母的質量控制及資源開發提供參考。

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（收稿日期：2020-02-24 修回日期：2020-06-04）

（編輯：唐曉蓮）