鼻咽癌易感性基因計量學分析及關鍵基因篩選

徐婉銀 熊 悅 倫永志

莆田學院藥學與醫學技術學院 醫學微生態學福建省高校重點實驗室，福建省莆田市 351100

鼻咽癌(Nasopharyngeal carcinoma，NPC)是高發于中國南方省份的一種上皮源性惡性腫瘤，具有明顯的地域特性和種群差異。因為鼻咽癌早期癥狀復雜且缺乏明顯特征，發病部位比較隱匿，所以鼻咽癌患者大多死于腫瘤的轉移而非原發疾病[1-2]。故此，早期診斷有無腫瘤的轉移并了解其轉移渠道對鼻咽癌的臨床治療至關重要。隨著現代分子生物學技術的發展，使我們對鼻咽癌相關分子標志物(如癌基因、抑癌基因、miRNA、細胞因子及其受體等)有了更深刻的認識。目前國內外對鼻咽癌相關分子標志物的研究日新月異[3]，本研究通過對近12年來國內外鼻咽癌易感性基因的相關文獻進行文獻計量學和生物信息學的統計分析，了解鼻咽癌易感性基因的研究趨勢和發展動態，提取關鍵基因，以期為鼻咽癌的分子診斷與研究提供基礎。

1 材料與方法

1.1 文獻檢索 檢索鼻咽癌易感性相關基因研究的文獻，檢索數據庫限定為NCBI Pubmed、中國知網(CNKI)和Web of science，時間限定為2008年1月—2020年1月。Pubmed檢索式：gene AND risk AND nasopharyngeal carcinoma；Filters：Publication，時間2008年1月1日—2020年1月1日。中國知網檢索式：主題詞為 “鼻咽癌 ”“易感性”“基因”，模糊匹配。Web of science檢索式：主題詞為“gene”“risk”“nasopharyngeal carcinoma”，時間為2008—2020年，檢索日期為2020年1月1日。

1.2 文獻納入與排除 納入標準：(1)納入的臨床研究均與鼻咽癌易感基因及基因產物相關；(2)納入的文獻形式包括會議論文、會議摘要及論著；(3)納入的文獻均可以獲取足夠信息的摘要或全文資料。排除標準：(1)排除針對基因結構、基因統計、Meta分析等的研究文獻；(2)排除書信、書籍、綜述及個案報道等；(3)排除與患鼻咽癌風險相關的非基因研究；(4)出版年份、題目及作者相同但來源數據庫不同的文獻，按1篇統計；(5)研究物種限定為人類，排除細胞株體外研究及動物體內實驗；(6)排除其他與本研究目的不符的文獻。

1.3 文獻計量學分析 借助EndNote X9軟件對最終納入的鼻咽癌易感性基因相關文獻進行管理并形成文獻數據庫，利用Microsoft Excel 2010軟件的統計功能，分別從作者、發表期刊、出版年、研究機構等角度進行計量學分析[4]。

1.4 鼻咽癌易感性相關基因的挑選及名稱標準化 統計納入文獻所研究的基因或基因產物，通過HUGO數據庫(http：//www.genenames.org/)進行基因名稱的標準化，而其余未能被識別的基因則通過NCBI Gene數據庫手工查詢。

1.5 鼻咽癌易感性相關基因生物信息學分析 將應用文獻計量學統計分析獲得的鼻咽癌易感性相關基因上傳至在線軟件STRING 11.0(https://string-db.org/)，對鼻咽癌易感基因表達的蛋白質進行網絡構建，并將所得的網絡數據導入Cytoscape 3.7.1軟件處理， 同時使用其插件Centiscape 2.2計算網絡及其各個節點的拓撲特性，設置Betweenness值和degree值篩選出瓶頸(Bottleneck)基因和關鍵(Hub)基因。

2 結果

2.1 文獻檢索 從Web of science數據庫中檢出文獻520篇，從Pubmed數據庫中檢出文獻337篇，從CNKI數據庫中檢出文獻117篇，共計974篇，去重后按照納入標準進一步篩選，確定納入文獻348篇。

2.2 文獻計量學分析 結果顯示，鼻咽癌易感性相關基因的研究文獻在2008—2016年間總體呈上升趨勢，而2016—2019年的文獻量逐漸下降，其中2014年與2016年文獻量升高尤為顯著，發文量最高的年份是2016年，為52篇(圖1)。

圖1 2008—2019年鼻咽癌易感性相關基因相關文獻出版年分布

共有195種生物醫學期刊上發表鼻咽癌易感性基因的相關文獻，文獻量達348篇。其中以Oncotarget刊文15篇高居榜首，Tumor Biology 14篇次之，發文量在5篇及以上的期刊還有Plos One(10篇)、Molecular Carcinogenesis(8篇)、Bmc Cancer(5篇)、Human Immunology(5篇)。

12年間在鼻咽癌易感性相關基因方面發文量最多的作者是中山大學的曾益新，發表相關文獻16篇。為避免數據統計的重復和遺漏，統計對象設定為第一作者所在機構，結果顯示有125個研究機構進行相關研究，國內以中山大學發表文獻最多，達到30篇，其次3個研究機構分別為廣西醫科大學(26篇)、中南大學(21篇)，右江民族醫學院(20篇)。

納入研究的鼻咽癌易感性基因文獻統計共有283個第一作者，涉及25個國家或地區，其中中國以246篇的發文量高居榜首，發文量>5篇的國家或地區主要有突尼斯(19篇)、中國臺灣(17篇)、美國(12篇)、印度(8篇)、葡萄牙(6篇)和馬來西亞(6篇)。

2.3 蛋白質互作網絡分析 將483個鼻咽癌易感性相關基因上傳至在線軟件STRING構建鼻咽癌易感性相關基因表達產物的互作關系網絡，共計有216個基因參與了蛋白質互作分析網絡構建(圖2)，由168個節點及723條邊構成(圖3)。Degree為節點連接的邊的總數目，度值范圍為1～48.00，平均度值為8.61。Betweenness為關系網絡中經過某節點的最短路徑的數量，數值范圍為0～8 316.81，平均值為303.98。Hub基因為Degree≥均數+1SD的蛋白所對應的基因，共有22個，Bottleneck基因為Betweenness≥均數+1SD的蛋白所對應的基因，共有8個。同時為Hub基因和Bottleneck基因的基因對互作關系網絡尤為重要，即為關鍵基因(表1)，分別為TP53、JUN、PIK3CA、AKT1、VEGFA、IL6和TNF，如圖3所示黃色節點，主要具有細胞增殖、細胞周期調控、細胞周期負調控、DNA損傷反應等功能，這些關鍵基因將是該領域未來的研究熱點。

表1 篩選獲得的關鍵基因

3 討論

從文獻計量學角度分析，國內外對于鼻咽癌易感性相關基因的研究主要集中在鼻咽癌的高發地區和科研影響力比較大的機構，其中中國占據重要地位。通過應用生物信息學方法分析入選的348篇文獻中所涉及的483個基因，得出的互作關系網絡圖表明，鼻咽癌易感性相關基因均處于相互作用的復雜關系網絡中，其中有多個基因位于網絡中的關鍵位置，提示這些關鍵基因是重要的作用靶點和研究熱點。

蛋白質互作關系網絡中的關鍵基因具有穩定基因調控網絡的重要作用，其變化將引起大量下游基因的表達變化，對整個網絡而言它們的改變是至關重要的[5]。TP53是一種調節轉錄的序列特異性DNA結合蛋白，它具有誘導細胞周期阻滯和凋亡的能力，能通過防止癌基因突變來預防癌癥[6]。有研究顯示，TP53基因突變可增加正常細胞癌變的概率和腫瘤的發病率，TP53基因SNP rs117562731位點多態性與鼻咽癌的發病風險顯著相關，此位點的突變有可能是導致鼻咽癌發生和發展的一個重要因素[7]。TP53密碼子72 pro/Pro基因型與局部鼻咽癌患者的無進展生存期(Progression-free-survival，PFS)和總生存時間(Overall survival，OS)相關，這種多態性的基因分型有助于預測鼻咽癌患者的臨床預后[8]。同時有研究證明TP53密碼子72snp是局部晚期鼻咽癌放療預后的獨立預測因子，特別是煙齡在20年以上的患者群體中。基于以上研究，我們強烈主張應禁止吸煙，以提高放射治療的療效，特別是對于攜帶與局部復發或遠處轉移高危相關的SNPs的患者[9]。腫瘤血管的生成是腫瘤產生及發展的關鍵，血管內皮生長因子(Vascular endothelial growth factor，VEGF)常通過觸發血管反應引起病理障礙，包括病理血管生成和組織水腫[10]。VEGF-2578 C等位基因攜帶者患鼻咽癌的風險顯著，就預后指標而言，VEGF-2578 C等位基因攜帶者與腫瘤大小和晚期腫瘤分期所定義的鼻咽癌侵襲型之間存在顯著相關性[11]。有研究人員探討VEGF-2578C/A基因多態性與中國人鼻咽癌的關系，指出VEGF-2578A等位基因攜帶者患鼻咽癌風險顯著增加，而-2578CC基因型鼻咽癌患者具有更高的腫瘤侵襲性，與-2578A等位基因攜帶者相比，分化差且處于晚期[12]。在廣西人群中VEGF-460 C 等位基因是鼻咽癌發生的易感基因，可明顯增加鼻咽癌患者淋巴結轉移的風險[13]。同時有研究表明VEGF-1154G/A多態性位點與鼻咽癌的發病風險具有相關性[14]。AKT1是一種抗凋亡蛋白激酶，其底物之一是MDM2蛋白。AKT1是細胞信號轉導的關鍵節點，在腫瘤的發生中起著重要作用。AKT1對MDM2的磷酸化促進MDM2進入細胞核，在細胞核中發揮下調p53活性的作用。有研究發現AKT1基因SNP4-5 AA中的一個雙SNP核心單倍型與NPC風險增加顯著相關[15]， AKT1基因中的兩個位點(單獨或聯合rs3803300和rs2494738)與預后相關[16]。白細胞介素6(IL-6)在EBV感染患者鼻咽組織巨噬細胞中表達，IL6-634基因的GG基因型與鼻咽癌復發風險相關，G等位基因是鼻咽癌復發的保護基因[17]。與正常鼻咽組織相比，鼻咽癌組織中c-Jun表達上調，Egr-1表達下調，c-Jun和Egr-1蛋白可以作為鼻咽癌早期診斷和預后預測的新的潛在生物標志物[18]。基因突變可以區分腫瘤的放射敏感性和放射抗性。癌基因突變可導致腫瘤的發生，并可為臨床抗癌治療提供潛在的治療靶點[19]。探討鼻咽癌放射敏感性與放射抵抗患者的腫瘤易感基因改變是否存在差異中，觀察到5個針對AKT1、PIK3CA、MET、TP53和STK11的放射敏感性特異性突變，提示PI3K/AKT和p53通路的遺傳改變參與了放射治療的反應[20]。在病毒感染免疫反應中，腫瘤壞死因子(Tumor Necrosis Factor，TNF)是一種由活化的巨噬細胞或單核細胞產生的促炎性反應的細胞因子，TNFA AA基因型攜帶者與鼻咽癌發病風險顯著相關[21]。

圖2 鼻咽癌易感性相關基因表達產物構建的蛋白質互作關系網絡圖

圖3 鼻咽癌易感性相關基因相互作用的關系網絡圖

鼻咽癌是由多種因素引起，其中遺傳多態性不僅與鼻咽癌的患病風險顯著相關，而且還影響鼻咽癌的侵襲進展和預后。了解遺傳變異對患者臨床結局的影響，可以更好地尋找鼻咽癌的生物標志物進行個體化治療，而臨床精確的治療和預后依賴于有效的生物標記物，這些標記物具有更強的篩選、診斷和監測腫瘤的能力。近年來依賴生物信息學的知識及方法參與癌癥的治療(基因治療和分子靶向治療)，已經取得了顯著的成就和臨床效益[22]。本研究基于生物信息學的方法對鼻咽癌易感性基因進行總結剖析，以確定關鍵基因作為潛在的生物標記物，并了解鼻咽癌靶向治療的研究進展。通過開展更加精細的研究與臨床相結合，對預防和早期診治鼻咽癌、明確鼻咽癌的發生機制具有重要的意義[23]。