siRNA藥物研發(fā)現(xiàn)狀調(diào)研

王正明

摘? 要：RNAi是近年來生命科學(xué)領(lǐng)域的重大發(fā)現(xiàn)，依據(jù)RNAi設(shè)計的siRNA藥物被認為有著巨大的應(yīng)用前景。國際上siRNA藥物的研發(fā)炙手可熱，國內(nèi)該領(lǐng)域卻幾乎還是空白。文章通過對siRNA藥物的原理、優(yōu)缺點、研發(fā)現(xiàn)狀，以及預(yù)計的應(yīng)用領(lǐng)域進行了全面的調(diào)研，從而為國內(nèi)該藥物的研發(fā)提供資料支持。

關(guān)鍵詞：siRNA藥物;RNAi;研發(fā)調(diào)研

中圖分類號：R91? ? ?文獻標(biāo)識碼：A

Progress Investigation of siRNA Drug Research and Development

Wang Zhengming

（University of Cambridge，Cambridge， Cambridgeshire， England，CB2 1TN）

Abstract：RNAi is an important discovery in the field of life sciences in recent years，and siRNA drugs designed based on RNAi are considered to have huge application prospects. The research and development of siRNA drugs are hot in the world，but the field is almost blank in China. This paper has conducted a comprehensive investigation on the principles，advantages and disadvantages，research and development progress，and expected application areas of siRNA drugs，with a view to providing data support for the research and development of the drugs in China.

Key words：SiRNA drugs;RNAi;Research and development investigation

一、RNAi原理

1998年，美國科學(xué)家Andrew Fire和Craig Mello發(fā)現(xiàn)在線蟲中雙鏈RNA能夠發(fā)揮特異的基因沉默作用[1]，并把該現(xiàn)象稱作RNA干擾（RNA interfering，RNAi），兩位科學(xué)家也因此獲得2006年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎。

RNAi是細胞內(nèi)調(diào)控基因表達的一種機制，主要的作用分子有三大類：小干擾RNA （small interfering RNA，siRNA），microRNA（miRNA），PIWI-interacting RNA（piRNA）。siRNA是一類長度在21—25個核苷酸的RNA分子，1999年英國科學(xué)家David Baulcombe在植物中首先發(fā)現(xiàn)[2]，它的前體為長的雙鏈RNA，包括內(nèi)源性的和外源性的。不同來源的雙鏈RNA前體在細胞內(nèi)被Dicer酶切割，形成短的雙鏈RNA，其中的一條鏈會與Argonaute等蛋白形成基因沉默復(fù)合體（RNA-induced silencing complex，RISC），根據(jù)堿基互補配對的原則，將與siRNA配對的靶mRNA切割或者抑制其翻譯，從而阻止了靶蛋白的合成，起到基因沉默的效果[3]。miRNA也是一類能夠調(diào)控基因表達的小RNA分子，與siRNA的不同之處主要在于前體，miRNA的前體是MIRNA基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，它能夠形成特定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)，從而被Dicer識別切割，而siRNA的前體是雙鏈RNA，兩條鏈?zhǔn)峭耆煌膩碓春彤a(chǎn)生機制[3]。piRNA是一類長度在26—30個核苷酸的小RNA分子，其產(chǎn)生機制尚未清楚，被發(fā)現(xiàn)主要在維持動物生殖系細胞基因組的穩(wěn)定性方面發(fā)揮作用[4]。

2001年德國科學(xué)家Thomas Tuschl首次發(fā)現(xiàn)，合成的siRNA轉(zhuǎn)入Hela細胞后，能夠引發(fā)特異性的基因沉默[5]，自此RNAi成了一種分子生物學(xué)實驗手段，同時也被寄希望在生物醫(yī)學(xué)研究與藥物開發(fā)領(lǐng)域有更大的應(yīng)用。

二、siRNA藥物設(shè)計

Tuschl研究組發(fā)現(xiàn)外源導(dǎo)入siRNA能夠引起基因沉默之后，2003年美國哈佛醫(yī)學(xué)院的Judy Lieberman設(shè)計了針對Fas基因的siRNA藥物，應(yīng)用于小鼠模型，發(fā)現(xiàn)能預(yù)防小鼠感染暴發(fā)型肝炎[6]。然而siRNA藥物用于治療人類疾病還有很多問題需要解決。

（一）設(shè)計策略

基因沉默的效率取決于siRNA的效率，高效率的siRNA分子能達到超過RT-PCR檢測極限的靶mRNA的抑制效果[7]。siRNA通常是長度為21—24個核苷酸的雙鏈RNA，GC含量為30%—50%，3端有兩個堿基的突出，每條鏈均為5磷酸與3羥基。設(shè)計siRNA藥物時主要應(yīng)考慮以下五點：

1.熱穩(wěn)定性

由于單鏈RNA極易被降解，因此siRNA的兩條鏈必須形成穩(wěn)定的配對，也就是要提高siRNA的熱穩(wěn)定性，以避免被迅速地降解。一般來說，雙鏈siRNA不用經(jīng)過任何化學(xué)修飾，本身即具有較高的熱穩(wěn)定性，但用2-氟核苷酸、2-氧甲基核苷酸、LNA等來代替普通核苷酸，能夠進一步提高siRNA的熱穩(wěn)定性。

2.抵抗核酸酶

人體內(nèi)的血清和細胞內(nèi)都含有大量的核酸酶，能夠降解RNA。為了抵抗核酸酶降解，需要對siRNA的堿基進行化學(xué)修飾，尤其對5和3末端的堿基進行化學(xué)修飾，能夠顯著提高siRNA對核酸酶的穩(wěn)定性。

3.延長體內(nèi)存在時間

未經(jīng)修飾的siRNA進入體內(nèi)約五分鐘即被肝臟和腎臟清除[8]，多糖修飾、膽固醇修飾能夠提高siRNA與血清蛋白的結(jié)合能力，從而延長siRNA在體內(nèi)的半衰期，這樣也就使siRNA進入靶組織的機會大大增加。

4.組織靶向特異性

如果藥物能夠靶向特異的組織，則藥物的利用效率就會得以提高，同時藥物對其他組織器官的副作用也會降低。siRNA藥物組織靶向性問題目前可以通過以下兩種手段來解決：一是局部給藥，比如針對眼疾采用玻璃體注射，針對呼吸道疾病采用吸入的方式;二是將siRNA附著到能夠結(jié)合到特定細胞表面的抗體或多肽上。

5.靶基因特異性

根據(jù)RNAi的原理，siRNA能夠作用于所有與之互補配對的靶mRNA。siRNA結(jié)合到非預(yù)期的靶mRNA并抑制這些基因的表達，這種作用稱作off-target，在siRNA藥物臨床應(yīng)用時會引發(fā)嚴重的副作用。Off-target可以通過以下兩個途徑將其可能性降到最低：一是盡可能嚴謹?shù)卦O(shè)計siRNA序列，減少與其他非靶基因的互補。由于人類的全基因組測序已經(jīng)完成，因此可以將設(shè)計好的siRNA序列在整個基因組上預(yù)測其靶基因，看是否存在off-target的可能。二是通過某些化學(xué)修飾，可以使siRNA與靶mRNA的識別更為嚴格[9-10]。

（二）待解決的問題

1.給藥方式

siRNA必須在體內(nèi)被運送至細胞質(zhì)內(nèi)，才能進入RISC復(fù)合體，作用于靶基因的mRNA，從而發(fā)揮藥效。不像線蟲與果蠅細胞那樣，大部分哺乳動物細胞都不能直接攝取siRNA。人體特定的器官系統(tǒng)，如呼吸系統(tǒng)、生殖系統(tǒng)、眼睛等，可以采用局部用藥或者直接注射siRNA的給藥方式。對于除此之外的其他器官系統(tǒng)，尚無臨床上有效運送siRNA藥物的方法。目前理論上的siRNA有效運送方式有以下幾種：

將siRNA雙鏈中的作用鏈的互補鏈共價交聯(lián)膽固醇，使之通過細胞表面LDL受體介導(dǎo)進入細胞[11];在對小鼠的研究中，利用膽固醇共價交聯(lián)的siRNA，作用于膽固醇轉(zhuǎn)運蛋白ApoB，使小鼠血清膽固醇含量降低30%。

將siRNA結(jié)合到抗體-脯胺融合蛋白，使之通過細胞受體介導(dǎo)的方式進入細胞;這種策略有望實現(xiàn)更高級別的細胞特異靶向，Lieberman研究組發(fā)現(xiàn)，融合蛋白能將siRNA運送至HIV感染的淋巴細胞，而不進入未被感染的淋巴細胞[12]。

將siRNA包裝進特定的脂質(zhì)體或納米顆粒，可以減少siRNA被吞噬細胞清除的概率，延長siRNA在循環(huán)系統(tǒng)中的時間。美國sRNA制藥公司Sirna Therapeutics使用脂質(zhì)體包裝的siRNA，成功地將siRNA運送至小鼠肝臟，并且抑制了肝炎B病毒的復(fù)制[13]。

使用能夠表達siRNA前體的病毒載體，但此手段出于安全性的考慮，很難適用于臨床應(yīng)用。

2.Off-Target

上文中已經(jīng)闡述了siRNA的off-target現(xiàn)象，化學(xué)修飾可以幫助避免off-target。在內(nèi)源的miRNA途徑中，miRNA第二個核苷酸對于miRNA-靶mRNA相互作用至關(guān)重要。美國制藥公司Rosetta Inpharmatics研究發(fā)現(xiàn)，對siRNA雙鏈中的作用鏈第二個核苷酸進行化學(xué)修飾，能夠抑制siRNA的off-target作用，而對其預(yù)期的對靶標(biāo)的作用無明顯影響[9]。

除了作用于非靶基因外，siRNA還可能通過干擾素途徑或者Toll樣受體途徑，引發(fā)免疫反應(yīng)。然而干擾素途徑一般不會被短于30個核苷酸的雙鏈RNA激活，并且在動物實驗中，通過Real-time RT-PCR也未檢測到有siRNA引起的干擾素反應(yīng)。可能引起反應(yīng)的Toll樣受體主要是一些針對病毒雙鏈RNA的受體，它們一般識別特異的序列，鑒于針對某個致病基因可以設(shè)計很多種siRNA，因此避免引起Toll樣反應(yīng)應(yīng)該可以通過篩選解決。

3. 抗藥性

在治療病毒引起的疾病以及癌癥時，由于病毒或者癌細胞復(fù)制時基因發(fā)生突變，使用siRNA藥物有可能出現(xiàn)抗藥性。由于siRNA藥物通過序列互補配對發(fā)生作用，因此一旦靶基因發(fā)生突變，siRNA不能作用于其mRNA，致病基因的蛋白就會表達，siRNA藥物將徹底失去藥效。

對于可能的抗藥性，理論上的解決方法是，設(shè)計針對靶基因保守區(qū)域的siRNA，此外，還可以使用多種siRNA靶向同一疾病的多個致病基因。如果還是無法解決抗藥性，可能就需要根據(jù)產(chǎn)生抗藥性后的突變靶基因序列，重新改變siRNA藥物的序列。

4.干擾內(nèi)源miRNA

siRNA藥物還有一個可能的毒性，就是干擾細胞內(nèi)源的miRNA。由于導(dǎo)入產(chǎn)生的siRNA前體和內(nèi)源的miRNA前體需要經(jīng)歷相似的處理過程，因此對于關(guān)鍵的作用因子，比如Dicer，都會產(chǎn)生競爭，這也就限制了臨床上siRNA的用藥劑量。目前該方面尚無確切的實驗數(shù)據(jù)。

三、國際國內(nèi)siRNA藥物研發(fā)現(xiàn)狀

siRNA藥物雖然理論上還有一些問題沒有得到完全解決，但國外的制藥巨頭公司早已瞄準(zhǔn)這個新藥研發(fā)領(lǐng)域，希望研制出新的siRNA藥物，對一些遺傳疾病以及傳染性疾病進行有效的治療。2018年第一個也是迄今為止唯一的一個siRNA藥物Onpattro獲得美國食品藥品管理局（FDA）批準(zhǔn)上市，用于治療遺傳性甲狀腺素介導(dǎo)的淀粉樣變性引起的神經(jīng)損傷。該疾病是由于病人體內(nèi)一類淀粉樣蛋白過度積累引起的，Onpattro通過抑制編碼該蛋白基因的mRNA來達到治療的目的。除此之外，siRNA藥物研發(fā)的領(lǐng)軍者——美國Alnylam公司正在研發(fā)針對肺移植過程中急性呼吸道合胞病毒感染的siRNA藥物，針對AAT介導(dǎo)的肝臟疾病以及肝癌的siRNA藥物，這些藥物均處于不同的臨床研究階段。美國Quark制藥公司也正在研發(fā)針對治療脈絡(luò)膜心血管形成導(dǎo)致的黃斑變性，以及心血管手術(shù)后的急性腎損傷等疾病的siRNA藥物。可以看出，目前國際上siRNA藥物的研發(fā)炙手可熱。

在國內(nèi)，siRNA藥物已經(jīng)被列入“十三五”生物產(chǎn)業(yè)發(fā)展規(guī)劃的重點發(fā)展領(lǐng)域。蘇州瑞博生物與美國Quark制藥公司共同開發(fā)的QPI-1007，通過抑制促凋亡蛋白半胱天冬酶2基因，針對治療非動脈炎性前部缺血性視神經(jīng)病變，也已經(jīng)進入臨床實驗階段。該研究是國內(nèi)進行的首個siRNA藥物臨床實驗。

四、結(jié)論

RNAi在各種基因沉默現(xiàn)象中所起的巨大作用，預(yù)示著RNAi不但是研究基因功能的一種有力工具，而且為特異性基因治療提供了新的技術(shù)手段，具有巨大的科研價值和社會經(jīng)濟價值。在基因藥物的研制與開發(fā)方面，根據(jù) 21個寡核苷酸siRNA能夠抑制同源mRNA的表達，人工設(shè)計合成外源性的21個寡核苷酸siRNA進行相關(guān)的遺傳疾病及傳染性疾病的藥物治療，治療那些現(xiàn)有藥物不能很好解決的疾病如SARS、艾滋病、各種腫瘤和遺傳性疾病。盡管siRNA藥物仍有問題尚未解決，但對于這些傳統(tǒng)藥物和手段無法治療的疾病來說，它無疑是一道曙光，承載著人類征服這些疾病的可能。

“沉默”是金。或許不遠的將來，國際生物制藥領(lǐng)域?qū)⒃诨虺聊≧NAi）領(lǐng)域掘得第一桶金。理論上一切已經(jīng)明確致病基因的疾病，都可以通過siRNA使之沉默，因此siRNA藥物有著廣闊的研究開發(fā)空間。國際上siRNA藥物研發(fā)領(lǐng)域的競爭日趨激烈，國內(nèi)這方面的工作才剛剛起步，我們要做的除了實驗室研究，解決這些siRNA藥物存在的問題之外，尋找可行的靶疾病自主進行siRNA藥物研發(fā)也是十分必要的。

參考文獻：

[1]Fire A，Xu S，Montgomery M K，et al.Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA in Caenorhabdits elegans[J]. Nature，1998（391）：806-811.

[2]Hamilton A J.A species of small antisense RNA in posttranscriptional gene silencing in plants[J]. Science，1999（286）：950-952.

[3]Carthew R W，Sontheimer E J.Origins and Mechanisms of miRNAs and siRNAs[J]. Cell，2009（136）：642-655.

[4]Klattenhoff C，William T.Biogenesis and germline functions of piRNAs[J]. Development，2008（135）：3-9.

[5]Elbashir S，Harborth J，Lendeckel W，et al.Duplexes of 21-nucleotide RNAs mediate RNA interference in cultured mammalian cells[J]. Nature，2001（411）：494-498.

[6]Song E，Lee S K，WANG J，et al.RNA interference targeting Fas protects mice from fulminant hepatitis[J]. Nature Medicine，2003（9）：347-351.

[7]Lee S K，Dykxhoorn D M，Kumar P，et al.Lentiviral delivery of short hairpin RNAs protects CD4 T cells from multiple clades and primary isolates of HIV[J]. Blood，2005（106）：818-826.

[8]Braasch D A，Paroo Z，Constantinescu A，et al.Biodistribution of phosphodiester and phosphorothioate siRNA[J]. Bioorg. Med. Chem. Lett.，2004（14）：1139-1143.

[9]Jackson A L，Burchard J，Leake D，et al.Position-specific chemical modifications of siRNAs reduces “off-target”transcription silencing[J]. RNA，2006（12）：1197-1205.

[10]Snove O，Rossi J J.Chemical modifications rescue off-target effects of RNAi[J]. ACS Chem. Biol.，2006，1（5）：274-276.

[11]Soutschek J，Akinc A，Bramlage B，et al.Therapeutic silencing of an endogenous gene by systemic administration of modified siRNAs[J]. Nature，2004（432）：173-178.

[12]Song E，Zhu P，Lee S K，et al.Antibody mediated in vivo delivery of small interfering RNAs via cell-surface receptors[J]. Nature Biotechnology，2005（23）：709-717.

[13]Morrissey D V，Lockridge J A，Shaw L，et al.Potent and persistent in vivo anti-HBV activity of chemically modified siRNAs[J]. Nature Biotechnology，2005（23）：1002-1007.