滋陰補(bǔ)腎方對(duì)糖尿病合并去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠病癥及骨代謝的影響

羅蒙， 江波， 徐鴻婕， 孫勤國(guó)， 呂琨， 楊倩， 張賢梅， 黃天慧

[1.武漢大學(xué)同仁醫(yī)院（武漢市第三醫(yī)院）中醫(yī)科，湖北武漢 430060）]

糖尿病是一種代謝紊亂性疾病，伴隨多種并發(fā)癥，其中糖尿病骨質(zhì)疏松（diabetic osteoporosis，DOP）發(fā)病率最高[1]。骨質(zhì)疏松的主要特征為骨量系統(tǒng)性減少、骨組織結(jié)構(gòu)退化，致骨強(qiáng)度降低，骨脆性增加[2-3]。進(jìn)入更年期的婦女由于卵泡數(shù)量明顯減少、卵巢功能低下、雌激素缺失和衰老的疊加作用，更易發(fā)生骨質(zhì)疏松[4]。本課題組前期研究結(jié)果顯示，滋陰補(bǔ)腎方對(duì)糖尿病合并去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠具有較好的治療效果[5]，本次研究在已有研究成果的基礎(chǔ)上，從糖尿病病癥及骨代謝方面探討滋陰補(bǔ)腎方的治療作用，以期為DOP 臨床藥物的開發(fā)應(yīng)用提供依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1. 1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物60 只 SPF 級(jí)雌性 SD 大鼠，3 月齡，體質(zhì)量（252 ± 18）g，購(gòu)于湖北省疾病預(yù)防控制中心，動(dòng)物質(zhì)量合格證號(hào)：42000600025698。飼養(yǎng)于華中農(nóng)業(yè)大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，溫度為23 ℃、濕度為60%左右，自然光源的環(huán)境中適應(yīng)性喂養(yǎng)動(dòng)物1周后進(jìn)行造模。

1. 2藥物、試劑與儀器滋陰補(bǔ)腎方由生龍骨30 g、生牡蠣30 g、桑寄生10 g、續(xù)斷10 g、淫羊藿10 g、天花粉10 g、黃連10 g組成，以上中藥材均購(gòu)自同仁醫(yī)院中藥房，經(jīng)過中藥傳統(tǒng)方法浸泡、煎煮、過濾、濃縮制成煎劑。骨化三醇軟膠囊由正大制藥（青島）有限公司生產(chǎn)（批號(hào)：1703211；規(guī)格：0.25 μg/粒）。高糖高脂飼料購(gòu)自北京華阜康生物科技股份有限公司；大鼠糖化血紅蛋白A1c（HbA1c）、胰島素（INS）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒均購(gòu)自武漢貝茵萊生物科技有限公司。352 型酶標(biāo)儀（芬蘭Labsystems Multiskan MS 公司）；URIT-8031 全自動(dòng)生化分析儀（桂林優(yōu)利特電子集團(tuán)有限公司）。

1.3分組、模型構(gòu)建與給藥將60只大鼠隨機(jī)分為正常組，模型組，骨化三醇組，滋陰補(bǔ)腎方低、中、高劑量組，每組10 只。除正常組外，其他5 組大鼠均建立DOP 模型，造模方法：腹腔注射10 g/L戊巴比妥鈉30 mg/kg麻醉大鼠成功后，仰臥位固定，常規(guī)消毒。無菌條件下于大鼠最末肋骨下腋中線至脊柱外側(cè)約1 cm 處備皮，切開皮膚、肌肉和腹膜，輕輕拉出脂肪團(tuán)暴露卵巢，結(jié)扎卵巢下端輸卵管，摘除雙側(cè)卵巢。止血后，逐層縫合，關(guān)腹，縫合切口，外敷消炎粉。術(shù)后正常喂養(yǎng)，切口每日消毒[6]。進(jìn)食高糖高脂飼料（配方：普通飼料中按質(zhì)量分?jǐn)?shù)添加20%蔗糖、15%熟豬油、10%蛋黃粉）14 d，禁食12 h 后一次性腹腔注射鏈脲佐菌素（STZ）30 mg/kg。取大鼠尾血測(cè)定空腹血糖值＞16.7 mmol/L，同時(shí)蘇木素-伊紅（HE）染色觀察大鼠脛骨骨小梁病理變化，判定模型是否構(gòu)建成功[6-7]。造模同期，正常組給予普通飼料喂養(yǎng)。造模成功后，骨化三醇組給予骨化三醇混懸液（以生理鹽水溶解）0.1 μg·kg-1·d-1灌胃；滋陰補(bǔ)腎方低、中、高劑量組分別按人與大鼠給藥換算比計(jì)算分別相當(dāng)于生藥量5、10、20 g·kg-1·d-1（體質(zhì)量）[5]給予滋陰補(bǔ)腎方灌胃；正常組與模型組大鼠進(jìn)行等量生理鹽水灌胃。灌胃給藥8 周，每日1 次。給藥期間，正常組繼續(xù)普通飼料喂養(yǎng)，其他各組繼續(xù)高糖高脂飼料喂養(yǎng)。

1. 4血糖、堿性磷酸酶（ALP）、鈣、磷及尿糖等生化指標(biāo)的測(cè)定采用自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)大鼠血糖、ALP、鈣、磷及尿糖水平。

1.5 ELISA法檢測(cè)大鼠血清空腹胰島素、HbA1c水平根據(jù)ELISA 試劑盒說明書操作。應(yīng)用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm 波長(zhǎng)處的吸光度，計(jì)算胰島素濃度、HbA1c含量。

1.6胰島素抵抗指數(shù)生化檢測(cè)空腹大鼠血糖水平，計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)。胰島素抵抗指數(shù)=空腹血糖×空腹胰島素/22.5。

1.7統(tǒng)計(jì)方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。所有數(shù)據(jù)均以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1滋陰補(bǔ)腎方對(duì)胰島素敏感指數(shù)的影響圖1結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組空腹血糖、胰島素水平以及胰島素抵抗指數(shù)顯著增加（P＜0.05）；與模型組比較，骨化三醇組，滋陰補(bǔ)腎方低、中、高劑量組大鼠空腹血糖、胰島素水平以及胰島素抵抗指數(shù)顯著降低（P＜0.05），且各治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.2滋陰補(bǔ)腎方對(duì)糖尿病癥指標(biāo)的影響圖2 結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組的血糖、尿糖、HbAlc 水平顯著升高（P＜ 0.05）；與模型組比較，骨化三醇組，滋陰補(bǔ)腎方低、中、高劑量組的血糖、尿糖、HbAlc 水平顯著降低（P＜0.05），且各治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。

2.3滋陰補(bǔ)腎方對(duì)骨代謝生化指標(biāo)的影響圖3結(jié)果顯示：與正常組比較，模型組的ALP、鈣、磷水平顯著下降（P＜0.05）；與模型組比較，骨化三醇組，滋陰補(bǔ)腎方低、中、高劑量組的ALP、鈣、磷水平顯著升高（P＜0.05），且各治療組比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞ 0.05）。

圖1 各組大鼠空腹血糖（A）、胰島素（B）及胰島素抵抗指數(shù)（C）水平比較Figure 1 Comparison of the levels of fasting blood glucose（A），insulin（B）and insulin resistance index（C）in rats of various groups

圖2 各組大鼠血糖（A）、尿糖（B）及HbAlc（C）含量比較Figure 2 Comparison of the levels of blood glucose（A），urine glucose（B）and HbAlc（C）in rats of various groups

圖3 各組大鼠磷（A）、鈣（B）含量及ALP活性（C）比較Figure 3 Comparison of phosphorus（A）and calcium（B）contents and ALP activity（C）in rats of various groups

3 討論

葡萄糖是促進(jìn)機(jī)體胰島細(xì)胞分泌胰島素的關(guān)鍵物質(zhì)，在一定范圍內(nèi)，由于反饋調(diào)節(jié)的作用，胰島素水平與血糖的升高呈正相關(guān)，即血糖短時(shí)間的增加可刺激胰島素的分泌。但如果血糖升高至一定程度后，持續(xù)的高血糖不僅不能促進(jìn)胰島素的分泌，還會(huì)導(dǎo)致胰島功能受損，并引起胰島β 細(xì)胞調(diào)亡，促使胰島β細(xì)胞加速衰退，進(jìn)而加重胰島素分泌不足的情況，促使高血糖的發(fā)生，形成惡性循環(huán)，即為葡萄糖毒性作用[8-9]。如果積極有效地控制血糖，則葡萄糖毒性作用可減輕甚至消失?？崭寡呛虷bAlc能反映機(jī)體的胰島β細(xì)胞功能和胰島分泌功能[10]。本研究結(jié)果顯示，滋陰補(bǔ)腎方低、中、高劑量組的血糖、尿糖、HbAlc水平顯著低于模型組（P＜0.05），提示滋陰補(bǔ)腎方能顯著改善糖尿病合并去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的糖耐量，減輕糖尿病癥狀，提高胰島分泌功能。

胰島素敏感性的經(jīng)典評(píng)估方法為穩(wěn)態(tài)模式評(píng)估法胰島素抵抗指數(shù)（HOMA-IR），可用來評(píng)估糖尿病患者的胰島素抵抗程度[11]。胰島素抵抗對(duì)骨密度存在一定的影響，Prado 等[12]的研究結(jié)果表明，胰島素抵抗可加重骨量的丟失，是骨質(zhì)疏松發(fā)生的危險(xiǎn)因素。呂燕等[13]研究結(jié)果也顯示胰島素抵抗可促使糖尿病腎病的發(fā)生，并導(dǎo)致骨代謝異常，加重糖尿病患者骨量的丟失。本研究結(jié)果顯示，經(jīng)滋陰補(bǔ)腎方處理后，滋陰補(bǔ)腎方低、中、高劑量組大鼠胰島素抵抗指數(shù)顯著低于模型組（P＜0.05），表明滋陰補(bǔ)腎方可能通過提高糖尿病合并去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠胰島素抵抗指數(shù)，緩解骨量的丟失。

此外，可以根據(jù)骨代謝的生化標(biāo)志物來了解骨代謝情況，判斷骨的轉(zhuǎn)換情況[14-15]。血清中的ALP水平可以反映成骨細(xì)胞的功能，是骨生成的標(biāo)志物，通?？梢员硎竟堑纳闪縖16]。鈣和磷是反映骨吸收的指標(biāo)，對(duì)骨質(zhì)疏松的發(fā)生程度具有指導(dǎo)意義。本研究結(jié)果顯示，滋陰補(bǔ)腎方低、中、高劑量組的ALP、鈣、磷水平較模型組顯著升高（P＜0.05），提示滋陰補(bǔ)腎方可改善糖尿病合并去卵巢骨質(zhì)疏松大鼠的骨代謝。

糖尿病骨質(zhì)疏松癥（DOP）屬于中醫(yī)“消渴”“骨痿”的范疇。滋陰補(bǔ)腎方基于“腎主骨”理論，從滋陰補(bǔ)腎入手，益氣養(yǎng)陰、滋腎壯骨[17]，可顯著改善DOP 大鼠的糖耐量，減輕糖尿病癥狀，提高胰島分泌功能，并改善骨代謝。鑒于滋陰補(bǔ)腎方在DOP 治療中具有潛在應(yīng)用前景，后續(xù)將進(jìn)一步深入探討，為其推廣應(yīng)用提供更多的基礎(chǔ)資料。