加減右歸飲對膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨退變的影響

王剛， 譚浩林， 陸超峰， 應(yīng)航

（1.杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院，浙江杭州 311400；2.浙江省紹興市中醫(yī)院，浙江紹興 312000；3.浙江中醫(yī)藥大學(xué)，浙江杭州 310053）

膝骨性關(guān)節(jié)炎主要是以軟骨退行性變、繼發(fā)骨質(zhì)增生為主要特征的慢性退行性骨關(guān)節(jié)病，其致殘率高[1-2]。中醫(yī)藥在治療骨與關(guān)節(jié)疾病中具有獨特優(yōu)勢，能有效地緩解膝骨性關(guān)節(jié)炎的臨床癥狀并提高患者的生活質(zhì)量。本課題組應(yīng)用源于《景岳全書》的右歸飲[3]加減在治療骨性關(guān)節(jié)炎中具有良好的臨床療效，但其作用機制尚不明確。故本研究構(gòu)建膝骨性關(guān)節(jié)炎大鼠模型，觀察大鼠體內(nèi)血液流變學(xué)、炎性反應(yīng)浸潤及關(guān)節(jié)軟骨退變的情況及加減右歸飲的干預(yù)作用，以期為臨床治療膝骨性關(guān)節(jié)炎提供科學(xué)依據(jù)，現(xiàn)將研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1. 1實驗動物SPF 級成年雄性SD 大鼠120 只，體質(zhì)量（160±15）g，購自中科院上海實驗動物中心，動物質(zhì)量合格號：ACXK（滬）2014-0027。設(shè)備、飼料等均由浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心提供。大鼠均在浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心實驗室飼養(yǎng)供藥，實驗室寬敞通風，飼養(yǎng)籠干凈清潔。

1.2藥物加減右歸飲由山藥、熟地黃、枸杞、山茱萸、杜仲、肉桂、制附子、甘草、肉蓯蓉、川牛膝等組成。將上述中藥材制成水煎劑，濃縮至1 g/mL，裝袋密封消毒，低溫冷藏，由浙江省杭州市富陽中醫(yī)骨傷醫(yī)院中藥制劑室提供。雙醋瑞因膠囊，由昆明積大制藥股份有限公司生產(chǎn)，批號：國藥準字J20140093，規(guī)格：每粒50 mg，10 粒/盒。

1.3主要試劑與儀器腫瘤壞死因子α（TNF-α）酶聯(lián)免疫吸附分析（ELISA）試劑盒（美國Cusabio公司）。YTX-3000 高解析度X 光檢測設(shè)備（美國Kodal公司）；DU 800分光光度計（美國Beckman公司）；4XC-MC三目倒置金相顯微鏡（德國Qiagen公司）。

1.4分組與動物模型的制備將120 只大鼠隨機分組為假手術(shù)組、模型組、加減右歸飲組、陽性對照組，每組30 只。將模型組、加減右歸飲組、陽性對照組大鼠根據(jù)Rogart 等[4]的Hulth 法構(gòu)建膝骨性關(guān)節(jié)炎模型：在無菌實驗室內(nèi)，將大鼠麻醉仰臥固定手術(shù)臺上，常規(guī)備皮、消毒、鋪巾，以髕骨為中心取雙膝關(guān)節(jié)內(nèi)側(cè)約3 cm 縱行切口，切開關(guān)節(jié)腔并將髕骨推向外側(cè)，直視下切除內(nèi)側(cè)半月板的前1/3部分、切斷前交叉韌帶，進行抽屜實驗陽性后沖洗、逐層止血縫合切口。假手術(shù)組同法打開關(guān)節(jié)腔，僅生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔，逐層止血縫合。術(shù)中注意關(guān)節(jié)軟骨的保護及無菌操作，術(shù)后雙膝關(guān)節(jié)不予石膏固定，連續(xù)4 周每日2 次驅(qū)趕大鼠進行負重活動，每次20 ～30 min。術(shù)后無大鼠感染及死亡情況。參照關(guān)節(jié)炎指數(shù)評分標準[5]對模型效果進行評估。

1.5給藥根據(jù)“人-大鼠體表面積比值”將人的日用臨床劑量[6]換算成大鼠給藥劑量，加減右歸飲組給予加減右歸飲7.56 g·kg-1·d-1灌胃，陽性對照組給予雙醋瑞因（溶于蒸餾水）2.33 mg·kg-1·d-1灌胃，假手術(shù)組、模型組給予等量蒸餾水灌胃。每日1次，給藥6周。

1.6取材給藥6 周后，腹腔麻醉后取腹腔靜脈血急送檢測，抽取大鼠雙膝關(guān)節(jié)腔灌洗液置于-80 ℃保存，再截取大鼠雙膝關(guān)節(jié)置于體積分數(shù)10%甲醛溶液中保存，以便觀察與檢測。

1.7觀察指標與方法

1.7.1 實驗期間一般情況觀察 主要觀察大鼠的體質(zhì)量、食欲、大小便、毛發(fā)色澤、精神狀態(tài)及下肢活動程度等情況。

1.7.2 X 線檢查 X 線檢查大鼠膝關(guān)節(jié)。根據(jù)大鼠骨關(guān)節(jié)炎的 X 線 Kellgren-Lawrence（K/L）分級法評估關(guān)節(jié)退行性病變程度，具體見表1。

1.7.3 血液流變學(xué)測定 腹腔麻醉、處死大鼠，取腹腔靜脈血，急送浙江中醫(yī)藥大學(xué)動物實驗中心測定血液流變學(xué)。

1.7.4 關(guān)節(jié)液中TNF-α含量的測定 實驗動物腹腔麻醉后切開關(guān)節(jié)腔，用生理鹽水沖洗關(guān)節(jié)腔后收集關(guān)節(jié)液。采用ELISA 法檢查TNF-α 表達水平，具體操作步驟按照試劑盒說明書進行。

表1 X線表現(xiàn)的Kellgren-Lawrence（K/L）分級Table 1 Kellgren-lawrence（K/L）grades of X-ray manifestations

1.7.5 組織病理學(xué)觀察及定量分析 將沿中心矢狀面切成兩半的雙側(cè)膝關(guān)節(jié)置于體積分數(shù)10%甲醛溶液中固定48 h，再通過0.27 mol/mL EDTA-2Na脫鈣2 個月，2 周更換脫鈣液后進行常規(guī)蘇木素-伊紅（HE）染色。光鏡下觀察其軟骨面、滑膜和細胞結(jié)構(gòu)等情況。通過Mankin’s 評分[7]定量分析軟骨損傷情況，具體見表2。

1.8統(tǒng)計方法采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進行分析，計量數(shù)據(jù)以均數(shù)±標準差（x±s）表示，組間兩兩比較采用t檢驗。以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

表2 Mankin’s 評分標準Table 2 Mankin’s scoring criteria

2 結(jié)果

2.1實驗期間各組大鼠一般情況比較假手術(shù)組排便、進食、精神狀態(tài)、皮毛無明顯異常變化，雙膝關(guān)節(jié)活動自如。模型組、加減右歸飲組和陽性對照組實驗大鼠造模結(jié)束1 d 后出現(xiàn)食欲不振、精神狀態(tài)不佳、膝關(guān)節(jié)淤血腫脹及對外界刺激敏感度不佳等情況；2周后，動物體質(zhì)量出現(xiàn)顯著差異，加減右歸飲組體質(zhì)量大于模型組，與陽性對照組相近；4周后，加減右歸飲組大鼠膝關(guān)節(jié)腫脹程度及活動度優(yōu)于模型組，與陽性對照組無明顯差異。

2.2各組大鼠膝關(guān)節(jié)X線表現(xiàn)比較圖1 結(jié)果顯示：假手術(shù)組膝關(guān)節(jié)間隙正常，關(guān)節(jié)軟骨表面平整光滑，無明顯骨贅及囊性病變，按照X線K/L分級法屬于“正常”；模型組膝關(guān)節(jié)間隙明顯變窄甚至消失，關(guān)節(jié)軟骨面不平整，關(guān)節(jié)游離，軟骨下骨破壞塌陷甚至關(guān)節(jié)半脫位，按照K/L分級法屬于“非常嚴重”；加減右歸飲組關(guān)節(jié)間隙輕度變窄，關(guān)節(jié)軟骨尚平整，少量骨贅形成，按照K/L分級法均屬于“中度”；陽性對照組膝關(guān)節(jié)X線大體表現(xiàn)與加減右歸飲組相似，關(guān)節(jié)間隙輕度變窄，關(guān)節(jié)軟骨變薄，中等量骨贅，輕度骨折硬化，按照K/L分級法均屬于“中度”。結(jié)果表明，加減右歸飲組與陽性對照組大鼠膝關(guān)節(jié)退行性病變明顯輕于模型組，重于假手術(shù)組，且2組退變程度接近。

圖1 各組大鼠膝關(guān)節(jié)X線表現(xiàn)比較Figure 1 Comparison of knee-joint X-ray manifestations in various groups

2. 3各組大鼠全血高切黏度比較表3 結(jié)果顯示：模型組全血高切黏度較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；加減右歸飲組全血高切黏度低于模型組，高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；加減右歸飲組全血高切黏度與陽性對照組相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 各組大鼠全血高切黏度比較Table 3 Comparison of the high blood viscosity in rats of various groups （x ± s）

2.4各組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α水平比較表4 結(jié)果顯示：模型組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α 水平較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；加減右歸飲組關(guān)節(jié)液中TNF-α 水平低于模型組，高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；加減右歸飲組關(guān)節(jié)液中TNF-α 水平與陽性對照組相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

2.5各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化與Mankin’s評分比較圖2結(jié)果顯示：假手術(shù)組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面光滑，軟骨細胞排列規(guī)整，可見完整潮線，軟骨下結(jié)構(gòu)清晰；模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨關(guān)節(jié)面缺損，軟骨細胞排列不規(guī)則，壞死甚至形成潰瘍；加減右歸飲組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面光滑，軟骨下結(jié)構(gòu)尚清晰，軟骨細胞排列較整齊，分布均勻，骨小梁的結(jié)構(gòu)與形態(tài)有部分碎裂；陽性對照組的鏡下改變與加減右歸飲組相近，2組軟骨細形態(tài)、排列及分布等鏡下改變均較模型組好轉(zhuǎn)。可見加減右歸飲組與陽性對照組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨面破壞、炎細胞浸潤明顯輕于模型組，重于假手術(shù)組，且2組在膝關(guān)節(jié)軟骨面破壞、炎細胞浸潤方面無明顯差異。

表4 各組大鼠關(guān)節(jié)液中TNF-α水平比較Table 4 Comparison of the TNF-α level in synovial fluid in rats of various groups （x ± s）

圖2 各組大鼠膝關(guān)節(jié)組織病理學(xué)變化比較（10×10）Figure 2 Comparison of the histopathological features in the rat knee-joints of various groups（10×10）

表5結(jié)果顯示：模型組Mankin’s評分較假手術(shù)組明顯升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；加減右歸飲組Mankin’s 評分低于模型組，高于假手術(shù)組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；加減右歸飲組Mankin’s 評分與陽性對照組相近，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞ 0.05）。

表5 各組Mankin’s評分比較Table 5 Comparison of Mankin’s scores in various groups （x ± s，s/分）

3 討論

骨性關(guān)節(jié)炎主要的病理因素是軟骨細胞、細胞外基質(zhì)以及軟骨下骨三者之間相互降解和合成功能失調(diào)引起的軟骨脫落和關(guān)節(jié)變形[8-9]。引起骨性關(guān)節(jié)炎軟骨病變的根本原因是軟骨細胞異常分化引起的Ⅱ型膠原蛋白降解與分解代謝因子（IL-1，IL-6，TNF-α）和合成代謝因子（TGF-β）信號通路的拮抗調(diào)節(jié)有關(guān)[10]，也有研究證實，炎癥因子與細胞凋亡對滑膜、關(guān)節(jié)軟骨以及軟骨下骨的破壞作用在骨性關(guān)節(jié)炎發(fā)生發(fā)展的病理過程中起著至關(guān)重要的作用[11]。其中，促進關(guān)節(jié)軟骨破壞和軟骨基質(zhì)降解中最重要的細胞因子是IL-1β 和TNF-α[12]。血流變學(xué)指標異常則可導(dǎo)致循環(huán)功能異常從而影響組織代謝，繼而加速了疾病的發(fā)生與發(fā)展[13]。本研究結(jié)果顯示：模型組大鼠膝關(guān)節(jié)軟骨關(guān)節(jié)面缺損，軟骨細胞排列不規(guī)則，壞死甚至形成潰瘍；模型組全血高切黏度、TNF-α 水平較假手術(shù)組明顯升高（P＜0.01）。與上述研究結(jié)果相符。

祖國醫(yī)學(xué)認為膝骨性關(guān)節(jié)炎屬“骨痹”范疇，其發(fā)病病機主要為風寒濕熱諸邪、勞損外傷內(nèi)侵、肝腎虧虛等，病理特點為“本虛標實”，標本兼治為其治療原則。中醫(yī)學(xué)家對于膝骨性關(guān)節(jié)炎的治療，多數(shù)倡用溫補，常用右歸飲加減，其不僅善補水中之陽使元陽得以回歸坎位，同時又能扶正驅(qū)邪通經(jīng)絡(luò)[15]。方中：熟地黃甘溫滋腎以填精，寓陰中求陽之意；枸杞子、山藥補肝血，助熟地黃以滋腎養(yǎng)肝；制附子、肉桂、肉蓯蓉溫補腎陽而祛寒；山茱萸、甘草補中養(yǎng)脾；杜仲、川牛膝益腎強腰脊。諸藥合用，具有溫陽補腎、補益精血之功效。現(xiàn)代研究表明熟地黃、附子能改善微循環(huán)、增強腎上腺皮質(zhì)分泌等功能[16]，枸杞子、山茱萸等能調(diào)整內(nèi)分泌、增強免疫功能[17]，山藥、杜仲等能改善和修復(fù)發(fā)生的龜裂、脫落及囊性變的關(guān)節(jié)軟骨[18]。

膝骨性關(guān)節(jié)炎的主要病理改變是膝關(guān)節(jié)軟骨的破壞，修復(fù)膝關(guān)節(jié)軟骨是治療膝骨性關(guān)節(jié)炎的關(guān)鍵。本研究中，無論是影像學(xué)表現(xiàn)、組織病理學(xué)檢測還是光鏡下Mankin’s 評分的結(jié)果均顯示：加減右歸飲組與陽性對照組大鼠關(guān)節(jié)軟骨損傷的程度高于假手術(shù)組，低于模型組，二者相近。提示加減右歸飲可在一定程度上抑制破骨細胞的活性，促進軟骨細胞修復(fù)，改善膝骨性關(guān)節(jié)炎。這與中醫(yī)腎為先天之本、主骨生髓的理念十分契合，加減右歸飲能溫腎益精，精生骨髓，骨髓充實，故骨骼強壯，運動捷健。

血流變指標異常、血黏度增加、紅細胞變形性降低與骨性關(guān)節(jié)炎的發(fā)生密切相關(guān)，通過改善骨性關(guān)節(jié)炎患者血流變可以緩解臨床癥狀[14]。本研究結(jié)果顯示：加減右歸飲組全血高切黏度較假手術(shù)組升高，但低于模型組，與陽性對照組相近。提示加減右歸飲可改善膝關(guān)節(jié)及周圍血運，促進靜脈回流，有利于炎性因子的吸收和軟骨細胞的再生。這與中醫(yī)心主血脈、心腎同源的學(xué)術(shù)理念相契合，加減右歸飲能溫補腎陽，溫煦化氣，心脈得以溫養(yǎng)，而血液的運行依賴于心氣的推動，血液通則脈絡(luò)通，脈絡(luò)通則四肢得養(yǎng)。

細胞因子TNF-α 在骨關(guān)節(jié)炎病程中發(fā)揮重要作用，若能有效抑制其參與骨關(guān)節(jié)炎病理軟骨的漸進性損傷，則能抑制破骨細胞的骨吸收活性，從而保護關(guān)節(jié)軟骨細胞。本研究結(jié)果顯示：加減右歸飲組關(guān)節(jié)液TNF-α 水平較假手術(shù)組升高，但低于模型組，與陽性對照組相近。提示加減右歸飲可在一定程度上下調(diào)關(guān)節(jié)滑膜的TNF-α 水平，抑制軟骨細胞凋亡率，可明顯改善病情。這與中醫(yī)“陰陽相濟”理論不謀而合，加減右歸飲能溫補水中之陽，使得陰陽得以相生，益精填髓，關(guān)節(jié)得以滑利，筋骨得以堅強，能有效對抗關(guān)節(jié)軟骨細胞凋亡，從而達到治病求本、標本兼治的目的。

綜上所述，加減右歸飲可活血通痹，改善靜脈回流，對關(guān)節(jié)軟骨細胞直接起保護作用，有利于改善膝骨性關(guān)節(jié)炎的病情；其還可通過抑制炎性浸潤和軟骨細胞凋亡的作用，促進軟骨細胞的生長與修復(fù)，發(fā)揮間接保護軟骨細胞的作用，達到治病求本的目的。