miR-132在氧糖剝奪誘導原代皮質神經元缺血損傷中的作用

楊利強，徐偉杰，關 欣

腦卒中是一種腦血管病變引起的神經功能喪失的神經系統疾病，分為出血性腦卒中和缺血性腦卒中，其中后者占60%～80%，具有死亡率高、發病率高、致殘率高等特點[1,2]。我國現有1100萬急性腦缺血患者，且每年新發病大約240萬人，腦卒中已成為我國居民第一位致死原因[3]。腦缺血發生后會導致缺血核心區神經元發生不可逆的壞死性死亡，而缺血半影區和周邊區域的神經元只是受到不同程度的缺血影響，這些神經元在血流恢復后即可幸存下來。研究表明，在缺血后24 h內，存活神經元會出現突觸結構水腫、傳導功能障礙，同時因損傷而丟失的突觸多達38%[4,5]。這些結果表明神經突觸對缺血性損傷十分敏感，因此，減少缺血周邊區突觸的丟失或促進這些突觸重新形成，是減輕缺血后神經功能缺陷的關鍵。

MicroRNA(miRNA)是一類由20-24個核苷酸組成的內源性小RNA。miRNA通過完全互補或者部分互補靶向mRNA的3’UTR區，誘導mRNA降解或者抑制mRNA翻譯，從而在轉錄后水平調控靶基因的表達[6～8]。目前，在人類基因組中已經證實約1500個基因由miRNAs編碼，在不同的生理和生存環境下調節各種mRNA表達[9]。在這些miRNAs中，miR-132在許多文章中被證實在神經元的發育和功能中起作用[9,10]。miR-132具有組織特異性，在神經相關的組織中高表達，參與軸突生長、突觸的增殖分化、神經遷移以及可塑性等過程[11,12]。因此闡明miR-132在調控突觸再生中的潛在機制，是抵抗缺血性再灌注損傷、恢復神經功能的一個重要方法。本研究擬通過培養皮質原代神經元利用缺糖缺氧(Oxygen and glucose deprivation，OGD)模擬腦缺血再灌注損傷模型，探討miR-132在腦缺血中的保護作用。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑 SPF級健康雌性成年懷孕Sprague-Dawley大鼠16～18 d；DMEM高糖培養基(Gibco)、DMEM無糖培養基(Gibco)、胎牛血清(Gibco)、Neurobasal Plus Medium(Gibco)、B27(Gibco)、谷氨酰胺(Sigma)、多聚賴氨酸(Sigma)、胰酶(Sigma)；攜帶相應miRNAs的重組慢病毒(Vector Builder)；Trizol(Invitrogen)； miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR(Exiqon公司)；SYBR Green Master Mix(TaKaRa)；CCK-8試劑盒(Sigma)；PSD95(abcam)、Synapsin-1(Cell Signaling Technology)、β-actin(Santa Cruz)。

1.2 原代大鼠皮質神經細胞的培養 無菌條件下，處死16～18 d懷孕SD大鼠取出胚胎浸泡于DMEM高糖培養基中置于冰上，斷頭取腦組織分離出胎鼠皮質組織，在體式顯微鏡下用眼科鑷剔除硬腦膜和血管等結締組織并將其剪碎。將剪碎組織轉移到0.125%胰酶中，37 ℃消化15 min，每5 min震蕩一次。用含10%胎牛血清的DMEM高糖培養基終止消化，并用其清洗3次。用自制的4種不同口徑的巴斯德管按照口徑從大到小的梯度輕柔吹打組織，吹勻皮質神經細胞懸液，觀察細胞存活率95%以上并計數接種，接種于事先多聚賴氨酸包被的6孔板中，接種適宜密度為7×105個。在37 ℃，5%CO2和飽和濕度的培養箱中培養4～6 h，此時神經元細胞已貼壁良好，棄去DEME完全培養基，換成nerubasal+B27+谷氨酰胺的培養基，在第3天加入阿糖胞苷抑制神經膠質細胞，以后每隔2 d進行一次半換液。

1.3 皮質神經細胞氧糖剝奪再灌注損傷模型的建立 在37 ℃、5%CO2、95%O2的培養箱中，用Nerubasal+B27+谷氨酰胺的培養基對皮質神經元細胞進行培養。本研究擬采用OGD細胞模型模擬缺血再灌注損傷，棄去原培養基更換為預溫的無糖DMEM培養基，然后將其放入37 ℃、5%CO2、95%N2培養箱中培養2 h。2 h后，將無糖DMEM培養基更換為預溫的Nerubasal+B27+谷氨酰胺培養基，在37 ℃、5%CO2、95%O2的培養箱中繼續培養24 h。

1.4 實驗分組和皮質神經細胞轉染 實驗分為假手術組(Sham)、氧糖剝奪再灌注損傷組(OGD)、慢病毒對照組(LV-control)、miR-132低表達組(LV-anti-miR-132)、miR-132過表達組(LV-miR-132)。除假手術組外，其余各組均進行氧糖剝奪再灌注損傷模型的建立。細胞接種后，在37 ℃、5%CO2、95%O2培養箱中培養。神經元培養至第7天將重組慢病毒LV-control、LV-anti-miR-132、LV-miR-132進行稀釋轉染，轉染24 h后換液繼續培養至第10天進行OGD處理。

1.5 皮質神經元存活率的檢測 將細胞接種于96孔板，氧糖剝奪2 h再灌注24 h處理后，換液并依照實驗要求每孔加入CCK-8試劑10 μl，37 ℃孵育4 h，用酶標儀在波長450 nm處讀取吸光度，計算皮質神經元細胞存活率。

1.6 Real-time PCR檢測各組miR-132的表達 將處理完后的細胞取出，用Trizol提取細胞總RNA，應用miRCURY LNATM Universal RT microRNA PCR進行逆轉錄反應，采用SYBR Green Master Mix法進行實時定量PCR擴增檢測各組miR-132的表達水平，引物序列(見表1)。擴增條件為：95 ℃ 10 min，95 ℃ 10 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 20 s；40個循環。每個樣品重復3次，獲得各孔的CT值，用2ΔΔCT計算各組的miR-132相對表達水平。

1.7 Western blot檢測蛋白表達 將按實驗要求處理完后的細胞取出，加入細胞裂解液，4 ℃裂解30 min，制備蛋白樣品，BCA法檢測各組樣本蛋白濃度。取20 μg蛋白樣品上樣進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉膜至PVDF膜上，室溫下10%脫脂牛奶封閉孵育2 h，隨后封閉一抗PSD95(1∶1000)、Synapsin1(1∶1000)、β-actin(1∶2000)，4 ℃搖床孵育過夜。TBST洗膜3次，HRP標記的二抗(山羊抗兔、山羊抗鼠)稀釋液(1∶10000)封膜，室溫搖床孵育1 h，再次TBST洗膜3次。加ECL化學發光底物，將PVDF膜充分浸入發光底物后放入暗盒，在暗室內紅外線燈下用X光片進行曝光。蛋白條帶用Image J軟件進行灰度值分析。

表1 Real-time PCR的引物序列

2 結 果

2.1 OGD處理后各組神經元細胞內miR-132表達水平的檢測 實時定量PCR結果(見圖1)。與Sham組神經元細胞中miR-132表達量相比，OGD誘導缺血損傷后miR-132表達水平明顯減少(P<0.05，見圖1)。與OGD組相比，過表達組(LV-miR-132)miR-132表達水平顯著上升(P<0.01，見圖1)，而低表達組(LV-anti-miR-132)只有降低趨勢無顯著性差異(見圖1)。

2.2 miR-132表達水平對OGD處理后神經元細胞活性的影響 如CCK-8結果所示，miR-132低表達明顯增加OGD導致的神經元細胞的損傷作用(P<0.05，見圖2)，而miR-132表達上調對OGD導致的神經元損傷有一定的抵抗能力。與Sham組相比，OGD組細胞存活率為53.6%，出現顯著減少(P<0.05，見圖2)；同OGD組相比較，低表達組(LV-anti-miR-132)細胞存活率呈現進一步減少(P<0.05，見圖2)，而過表達組(LV-miR-132)細胞活力出現一定程度的升高(P<0.01，見圖2)。

2.3 miR-132表達水平對OGD處理后神經元細胞突觸相關蛋白的影響 通過Western blot檢測了OGD缺血損傷后miR-132不同表達水平對神經元突觸相關蛋白的影響，結果(見圖3)：與Sham組比較，OGD組Synapsin-1和PSD95蛋白表達減少(P<0.05，見圖3)；同OGD組相比，過表達組(LV-miR-132)Synapsin-1和PSD95的蛋白表達水平明顯上調(P<0.01，見圖3)，說明miR-132可能通過調控突觸的可塑性，改變突觸相關蛋白的表達水平抵抗OGD導致的缺血損傷。而低表達組(LV-anti-miR-132)相較與OGD組Synapsin-1和PSD95的蛋白表達水平有一定的下降趨勢,但是無顯著性差異。

圖1 Real-time PCR檢測不同處理對皮質神經元中miR-132表達水平的影響

圖2 CCK-8檢測各組皮質神經元細胞的存活率

圖3 Western blot檢測miR-132表達水平對突觸相關蛋白的影響

3 討 論

本研究證實，OGD誘導原代皮質神經元細胞缺血損傷后miR-132表達水平下降；低表達miR-132可以加劇OGD誘導原代皮質神經元細胞死亡率，過表達miR-132表達水平則可以減輕OGD誘導的缺血損傷，增加原代皮質神經元細胞的活力，這其中的作用機制可能與miR-132調控突觸的可塑性，改變突觸相關蛋白的表達水平存在一定的聯系。

MiRNA-132是一種富集于腦內的神經組織特異性表達的miRNA[13]。MiR-132在神經功能方面具有重要作用，參與了許多神經生理和病理過程而被稱為“NeurimmiR”。體外研究證實miR-132過表達會增加GluR1、谷氨酸受體亞型NR2A、NR2B等突觸相關蛋白的水平[14]。此外，體內研究發現，在嗅球、海馬和紋狀體等再生能力旺盛的腦區，高表達的miR-132會促進神經干細胞分化成的新生神經元整合到神經網絡中，增加突觸連接的形成和神經遞質的傳遞[12,15]。還有研究證實，過表達的miR-132可以通過抑制靶基因p250GAP表達水平增加突觸的分支和樹突棘的數目來促進突觸發生和維持突觸結構的穩定[16,17]。在腦缺血模型中發現，miR-132低表達，不利于神經元存活和突觸功能重塑；而miR-132過表達可以減少腦缺血后神經元死亡，促進神經再生，建立新的突觸連接[18]。

我們的研究結果與其他研究基本一致，皮質神經元細胞經過OGD缺血損傷后會出現大量的神經元死亡，miR-132低表達會加劇損傷導致神經元死亡率進一步降低，而過表達miR-132可以減輕OGD造成的缺血損傷，提高神經元的存活率。Western blot結果顯示：相較于OGD組，過表達miR-132可以上調Synapsin-1和PSD95的蛋白表達水平且具有顯著差異，miR-132低表達會使Synapsin-1和PSD95的蛋白表達水平出現一定程度的下降但無顯著差異。所以我們推測miR-132可能是通過影響突觸相關蛋白的表達水平，調控突觸的可塑性在OGD缺血損傷中起到保護作用，但是更具體的機制需要進一步研究。