寡聚態β淀粉樣蛋白加劇小膠質細胞衰老

魏 振，崔曉麗，陳曉春，潘曉東

老化或衰老(aging)是阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)最重要的危險因素[1,2]。細胞衰老(Cellular senescence，CS)是器官衰老的重要組成部分[3]，CS在驅動衰老及其相關疾病如阿爾茨海默病、帕金森病等神經退行性疾病的發展中起重要作用[4]。小膠質細胞是中樞神經系統定居的免疫細胞，正常腦內靜息狀態的小膠質細胞對神經系統發揮積極的免疫監視、穩態維持、神經環路的重塑與修復[5]以及調節神經發生等作用，對維持神經元的和正常的學習記憶具有極其重要的功能[6]。近年來，小膠質細胞年齡相關性的激活和表型改變(衰老相關分泌表型)一直是AD衰老學說的主要研究內容[7,8]。研究表明，寡聚態Aβ(Oligomeric Amyloid beta，oAβ)刺激小膠質細胞導致炎癥性級聯反應最強，是加劇神經元的損傷進而導致AD患者認知障礙的普遍機制。尸檢發現AD患者腦內小膠質細胞出現形態學異常[9]，實驗室既往研究顯示oAβ預處理的小膠質細胞對纖絲支狀Aβ的吞噬功能明顯降低[10]。作為腦內重要的固有免疫細胞，功能障礙尤其是老化的小膠質細胞在AD發病機制中作用仍未闡明[7,8,11]，小膠質細胞是否出現自發衰老現象以及oAβ是否直接誘導小膠質細胞衰老和DNA損傷反應(DNA damage response，DDR)國內外文獻鮮有報道。本研究旨在觀察小膠質細胞體內體外衰老現象，體外研究Aβ對其影響。

1 材料和方法

1.1 動物 本實驗腦組織染色所用小鼠為C57BL/6J 背景的雄性鼠，成年鼠在福建醫科大學實驗動物中心無特定病原菌級(special pathogen free，SPF)環境繁殖飼養，原代培養用動物為出生1 d新生小鼠。

1.2 藥物及試劑 凍干粉Aβ1-42購自Anaspec公司，Iba1一抗購自Wako公司，羊抗兔二抗、羊抗小鼠二抗均購自KPL公司。乙二醇和乙酸鈉二甲基亞砜(DMSO)均購自Sigma公司，生物素標記羊抗兔二抗購自Vector公司； Alexa Fluor488標記羊抗鼠IgG、DAPI購自上海生工。胎牛血清、DMEM培養基、0.25%胰酶-EDTA、青霉素和鏈霉素購自Hyclone公司，Anti-γH2AX(ab2893)抗體購自Abcam公司。

1.3 oAβ1-42的制備 寡聚態Aβ1-42的制備參考本實驗室前期方法[10]。簡言之，凍干粉Aβ1-42經100%的HFIP溶解后風干至底部可見膜狀物。用少量DMSO溶解(終濃度為5 mmol)，重懸于無酚紅Ham’s F-12培養基,配成濃度為100 μmol的母液,水浴超聲10 min、渦旋，4 ℃孵育24 h后，分裝保存于-80 ℃備用。

1.4 免疫組織化學染色 3 m齡和18 m齡小鼠麻醉后取腦，固定，冰凍切片機(CM1950，Leica，Germany)制作腦片，冠狀位切成40 μm 厚度(參考小鼠腦立體定位圖譜取額葉皮質)存于凍存液；用TBS 漂洗腦片上的凍存液，隨后用3%過氧化氫處理10 min去除組織內源性的過氧化氫酶，再漂洗，室溫封閉1 h，孵育一抗(Iba1 1∶2000稀釋，4 ℃ 48 h)，TBST漂洗后孵育生物素標記的抗鼠二抗(1∶600稀釋)，孵育ABC放大液，DAB(2 mg/ml)顯色。 乙酸鈉和TBS 漂洗后行組織SA-β-GAL染色，方法參考文獻進行[12]。簡言之，1 mg/ml的x-gal反應液37 ℃孵育16 h(避光)，然后PBS液洗滌兩遍，后固定4 min(后固定液70%乙醇：福爾馬林：冰醋酸為20∶2∶1)，沖洗，貼片于多聚賴氨酸包被的載玻片，封片，拍照。

1.5 原代小膠質細胞培養 采用新生24 h內C57BL/6J小鼠，噴灑酒精消毒、斷頭，取腦，分離大腦皮質，木瓜蛋白酶的鹽溶液消化、吹打，收集細胞并計數，接種。培養至12～14 d取出，放入搖床振搖，260 rpm，1～2 h。離心去上清，收集沉淀即獲得純化的小膠質細胞，以1×105個/孔接種于含有細胞玻片的24孔板用于實驗需要，從純化接種后開始計算培養時間。

1.6 小膠質細胞SA-β-GAL染色步驟 SA-β-GAL細胞化學染色亦參考文獻進行[12]。取出預先接種有小膠質細胞的玻片，4 ℃ 0.01 mol PBS沖洗后用2%甲醛-0.2%戊二醛固定10 min，PBS洗兩遍，予1 mg/ml的x-gal反應液37 ℃孵育4 h(避光)，PBS洗滌，后固定4 min(后固定液70%乙醇：福爾馬林：冰醋酸為20∶2∶1)，雙蒸水沖洗。核固紅復染5 min后烤干，中性樹膠封片。每張片計200個細胞，確定SA-β-GAL陽性細胞數百分比(n=3)。

1.7 小膠質細胞免疫熒光單標 原代培養小膠質細胞Aβ處理后，PBS洗兩次，經多聚甲醛固定后PBS漂洗。室溫下封閉后孵育一抗Iba1，設置陰性對照。PBST漂洗后孵育二抗(Alex Fluor 488 Goat Anti-Mouse IgG，1∶1000 稀釋)，DAPI(1∶5000)復染細胞核。貼片于載玻片，封片。共聚焦顯微鏡LSM 780(Carl Zeiss,Germany)拍照、分析結果。

1.8 小膠質細胞免疫化學染色 小膠質細胞γH2AX細胞化學染色一抗步驟同細胞免疫熒光，孵育生物素標記兔抗IgG，隨后室溫孵育Vector Elite avidineperoxidase，DAB Ni顯色，貼片封片同前。拍照、ImageJ軟件分析圖片。

2 結 果

2.1 老年鼠腦內出現小膠質細胞自發衰老表型 通過對3 m齡年輕鼠和18 m齡老年鼠腦組織行Iba1免疫組織化學染色，可以看到年輕鼠小膠質細胞呈高度分支或網態(ramified phenotype)，胞體小，分支清晰明顯，為靜息狀態，且細胞之間排列有序，無明顯空白區域，監視范圍大(圓圈所示),無SA-β-GAL陽性細胞(見圖1A)。相反，老年鼠腦片(見圖1B)染色看到小膠質細胞分支扭曲、斷裂、細短，欠清晰，細胞之間排列紊亂，如藍色圓圈所示，細胞監視范圍小，細胞之間存在空白區域，部分呈阿米巴樣形態(activated amoeboid shape)，提示一定的衰老或營養不良狀態(dystrophic senescent phenotype)。重要的是，如箭頭所示，鏡下可見一定數量的Iba1與SA-β-GAL共定位細胞，SA-β-GAL主要存在于胞體的胞漿，以上結果提示老化使小膠質細胞產生明顯的衰老相關表型，即在體的小膠質細胞呈現自發衰老現象。

2.2 體外原代小膠質細胞的純化鑒定 Iba-1幾乎在所有的體內外小膠質細胞高表達，是小膠質細胞特異性標記物。原代培養的小膠質細胞(primary microglia,PM) 經過Iba1免疫熒光染色顯示為綠色，細胞核通過DAPI 復染顯示為藍色，不同視野計數500個細胞,計算Iba-1陽性與DAPI陽性比率，結果顯示本實驗PM細胞純度達94%以上，可滿足實驗需求(見圖2)。

2.3 小膠質細胞在體外顯示增齡性衰老變化 SA-β-GAL染色陽性是細胞衰老的重要標志物。為觀察體外培養的原代小膠質細胞是否出現衰老特征，通過獲取同一批新生鼠培養的原代小膠質細胞進行同條件小膠質細胞原代培養，分別于體外培養(Culture in vitro,DIV)至2 d(DIV2)、5 d(DIV5)、8 d(DIV8)以及11 d(DIV11)時取出立即行SA-β-GAL細胞染色。SA-β-gal染色陽性細胞，胞漿為青綠色，SA-β-GAL陰性的細胞，細胞核快紅復染為紅色。純化的小膠質細胞在體外2 d時SA-β-GAL染色陽性率僅為25.04%(25.04%±6.523%)，培養至5 d升至42.47%(42.47%±5.852%)，同2 d相比差異有統計學意義(P<0.001)；體外培養至8 d(87.42%±8.138%)和DIV11(94.20%±4.884%)明顯大于培養至5 d(P<0.001)，DIV8以及DIV11時絕大部分出現SA-β-GAL染色陽性，提示體外培養時間延長，小膠質細胞顯示增齡性衰老變化(見圖3)。

2.4 寡聚態Aβ加劇小膠質細胞體外衰老 首先，為了進一步觀察體外Aβ誘導的小膠質細胞衰老是否出現經典的SA-β-gal陽性，不同劑量(含等劑量DMSO對照組，0.5 μm/L，1.0 μm/L)的寡聚態Aβ處理原代培養的小膠質細胞4 h和24 h后行SA-β-gal染色，明場拍照顯示細胞輪廓計數。結果顯示，與對照組相比，0.5 μmol和1.0 μmol處理24 h均明顯增加小膠質細胞SA-β-gal染色陽性率(P<0.001)，且1.0 μmol濃度組SA-β-gal陽性率較前者高，提示一定的濃度依賴性。相比對照組，0.5 μmol作用4 h組盡管存在增加趨勢但無出統計學意義(P>0.05)；與此同時，1.0 μmol作用4 h組較相應空白對照組SA-β-gal陽性率增加(P<0.05)。以上結果提示Aβ加快體外小膠質細胞衰老(見圖4)。

2.5 小膠質細胞衰老可能與DNA損傷有關 γH2AX作為一種衰老生物標志物，可反映DNA損傷程度。為研究oAβ是否通過增加小膠質細胞DNA損傷反應。0.5 μmol oAβ分別處理小膠質細胞4 h(4 h)、24 h(24 h)后行γH2AX細胞化學染色,γH2AX陽性為細胞核內呈點狀或斑片狀黃色致密物(黑色箭頭)，胞漿無著色。與空表對照組相比，0.5 μmol oAβ處理24 h后小膠質細胞細胞核內γH2AX化學染色強度明顯增加(P<0.05)，點密度定量分析增加48%。對照組多為背景染色，僅個別細胞出現。盡管0.5 μmol 4 h組存在增加趨勢，但無統計學意義。以上結果提示oAβ加速小膠質細胞衰老可能增加γH2AX表達誘發DNA損傷反應(見圖5)。

小膠質細胞Iba1及SA-β-GAL共染色(n=5)。A：3 m齡；B：18 m齡。bar=20 μm

柱狀圖Iba1(綠色)陽性與DAPI(藍色)陽性比值百分比n=3。bar=20 μm

小膠質細胞體外不同時間(DIV2、DIV5、 DIV 8、DIV 11)SA-β-gal染色，n=3。柱狀圖統計分析結果,***P<0.001表示DIV5、DIV8、DIV11 vs.DIV2；###表示DIV8或DIV11 vs DIV5；bar=20 μm

A～F：oAβ處理小膠質細胞后SA-β-gal染色，n=3。Bar=20 μm。G:SA-β-gal陽細胞性百分比。*P<0.05 ：1 μmol干預4 h組與相應的對照組比。*** P<0.001：0.5 μmol和1 μmol干預24 h組與相應對照組比

A：0.5 μmol oAβ處理小膠質細胞4 h、24 h后行γH2AX染色，n=4，bar=20 μm。B：相對γH2AX 點密度分析*P<0.05

3 討 論

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種發病機制未明的退行性病變，主要表現為進行性認知功能障礙、日常生活能力下降，常伴有行為和情感的異常[13]。近年以發現小膠質細胞功能相關基因SNP突變(ABCA7、TREM2、CD33等)為晚發型AD危險因子[14,15]支持AD發病的免疫衰老學說[16]。本研究在體發現老年鼠腦內小膠質細胞出現形態上的營養不良和SA-β-gal染色陽性，或許可以部分解釋老年鼠認知障礙；這與前期AD腦內尸檢結果一致[17]。

不同于永生化的小膠質細胞系如BV2、CHME-5，本實驗使用原代培養小膠質細胞可以更好的模擬動物疾病研究。小膠質細胞在純化之前與膠質細胞共培養，純化后純度高達94%以上，保證實驗的準確性、可靠性。體外培養結果表明，一定時間范圍內，小膠質細胞體外培養之間越長，SA-β-gal染色陽性率越高，這可能與老化的小膠質細胞代謝廢物的蓄積，導致細胞內溶酶體半乳糖苷酶表達(GLB1基因的轉錄和翻譯)的增加有關[18]。

過度沉積的Aβ刺激膠質細胞分泌大量的細胞因子和炎癥介質，如TNF-α、IL-1β、IL6等，對神經元產生毒性作用導致AD發病的經典機制[19]。近年研究顯示Aβ對膠質細胞老化產生重要影響。為了回答Aβ是否加速小膠質細胞的衰老這一核心問題。我們發現oAβ處理小膠質細胞后明顯增加小膠質細胞SA-β-gal陽性率，與既往Aβ加速海馬神經干細胞[20]和腦內血管內皮細胞衰老的研究結果一致[21]。此外，也有學者報道高濃度的Aβ1-42可導致體外星形膠質細胞SA-β-gal陽性增加[22]，提示作為Aβ始作俑者在神經退行性疾病發病過程中誘發膠質細胞功能障存在一定的普遍性。

除端粒縮短導致復制衰老外[23]，目前已知的觸發細胞衰老的因素還包括異常癌基因(p16,p21,p53等)的激活、電離輻射、氧化應激、自噬功能障礙以及DNA損傷反應(DDR)等[2,23]。DDR直接體現于染色體結構改變和組蛋白H2AX的活化異常。在各種理化因素刺激下，細胞DNA雙鏈發生斷裂，染色體組蛋白H2A家族成員H2AX上的第139位絲氨酸發生磷酸化修飾，形成γH2AX是細胞衰老的直接體現和重要標記。動物實驗顯示，衰老的組織如肺泡、肝臟、脾臟、小腸等組織器官中激活的組蛋白H2AX明顯活化，即γH2AX表達上調[24]。臨床研究表明，與對照組相比，AD患者腦內γH2AX表達明顯亦增加[25]。甚至有學者提出患者外周血淋巴細胞γH2AX表達上調可作為AD早期診斷分子標記物[26]。為此，本實驗對Aβ處理后小膠質細胞γH2AX表達進行了研究，結果證實oAβ增加γH2AX表達。提示Aβ加速細胞衰老可能通過DNA損傷反應。

綜上所述，本研究揭示小膠質細胞存在自發衰老現象，β淀粉樣蛋白加快小膠質細胞衰老進一步支持免疫衰老在AD發病中的作用[16]，為從小膠質細胞角度探索AD發病機制提供一定的理論依據。盡管小膠質細胞表達衰老相關標記物，但其衰老具體分子信號通路、衰老表型的功能改變以及體內體外的異質性需要未來進一步深入研究，尤其是如何找到干預小膠質細胞老化的藥物靶點。未來抗衰老和調節免疫研究有望成為AD發病機制和治療靶點新方向[27]。