線(xiàn)粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作綜合征的肌肉病理和電鏡特征

吳世陶，劉 方，石偉偉，張 敏，郭亞培，劉恒方

線(xiàn)粒體腦肌病伴高乳酸血癥和卒中樣發(fā)作(mitochondrial encephalomyopathy with lactic acidosis and stroke-like episodes，MELAS)是由于線(xiàn)粒體DNA(mtDNA)或核DNA(nDNA)突變而導(dǎo)致線(xiàn)粒體結(jié)構(gòu)和功能異常的一組綜合征。MELAS綜合征臨床表現(xiàn)復(fù)雜，容易漏診和誤診，肌肉活檢病理具有十分重要的診斷價(jià)值。電鏡能夠觀察肌肉細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)，為診斷MELAS綜合征提供形態(tài)學(xué)依據(jù)。我們總結(jié)33例MELAS綜合征患者肌肉病理及電鏡的特征，以提高對(duì)它們的認(rèn)識(shí)。

1 資料與方法

1.1 一般資料 收集2013年1月-2019年1月鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院和鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院經(jīng)肌肉病理和基因測(cè)序同時(shí)確診的33例MELAS綜合征的資料，其中男20例，女13例，年齡4.2～39歲，病程2 m～10 y，多為青少年起病，主要臨床表現(xiàn)為癲癇、卒中樣發(fā)作、頭痛、身材矮小、不耐受疲勞、視力下降、聽(tīng)力下降和多毛等。33例患者均發(fā)現(xiàn)基因突變位點(diǎn)。研究獲得鄭州大學(xué)第五附屬醫(yī)院倫理委員會(huì)的批準(zhǔn)，且患者或家屬簽署知情同意書(shū)。

1.2 肌肉病理 患者或者監(jiān)護(hù)人簽署知情同意書(shū)，局麻下獲得骨骼肌標(biāo)本，根據(jù)病情取材部位為肱二頭肌或者腓腸肌。新鮮標(biāo)本分兩部分，一部分行肌肉組織病理染色；另一部分行電鏡檢查。新鮮肌肉標(biāo)本經(jīng)液氮冷卻的異戊烷迅速冷凍，-80 ℃保存，染色時(shí)制成8 μm冷凍切片，進(jìn)行蘇木精-伊紅(HE)、改良Gomori (MGT)、還原型輔酶Ⅰ四氮唑還原酶(NADH)、琥珀酸脫氫酶(SDH )、細(xì)胞色素C氧化酶(COX)、過(guò)碘酸雪夫氏(PAS)和油紅O(ORO)染色，顯微鏡200倍下進(jìn)行病理分析，發(fā)現(xiàn)破碎紅纖維(RRF)后隨機(jī)選取10個(gè)視野計(jì)算RRF出現(xiàn)率，RRF出現(xiàn)率=(RRF個(gè)數(shù)/肌纖維總數(shù))×100%。15例新鮮標(biāo)本經(jīng)2.5%戊二醛固定，行透射電子顯微鏡檢查。

2 結(jié) 果

2.1 肌肉病理 光鏡下HE染色可見(jiàn)部分肌纖維變性、壞死、萎縮，18例可見(jiàn)破碎紅纖維，其胞漿出現(xiàn)嗜堿性顆粒沉積。25例改良Gomori染色可見(jiàn)破碎紅纖維；26例NADH染色可見(jiàn)破碎紅纖維，氧化酶活性增高；28例SDH染色可見(jiàn)破碎藍(lán)纖維，氧化酶活性明顯增高；26例可見(jiàn)SSV現(xiàn)象，其中2例未見(jiàn)到破碎藍(lán)纖維和破碎紅纖維；22例COX染色光鏡下見(jiàn)到氧化酶活性消失或減低，即COX陰性肌纖維；15例PAS顯示糖原成分輕度增高；24例ORO染色可見(jiàn)脂肪成分增多(見(jiàn)圖1)。

2.2 電鏡 15例MELAS綜合征患者電鏡下均可見(jiàn)到肌原纖維排列紊亂、間質(zhì)水腫，線(xiàn)粒體數(shù)量明顯增多，大部分聚集在肌膜下或者肌原纖維間，線(xiàn)

粒體嵴紊亂、體積增大，部分患者可見(jiàn)巨大線(xiàn)粒體，均可見(jiàn)到線(xiàn)粒體內(nèi)結(jié)晶樣包涵體呈“停車(chē)場(chǎng)”樣排列(見(jiàn)圖2)。其中13例出現(xiàn)大量脂滴，9例糖原顆粒增多。此外，8例出現(xiàn)線(xiàn)粒體空泡化，5例溶酶體異常、脂褐素沉積，3例線(xiàn)粒體嵴呈同心圓排列，2例肌漿網(wǎng)擴(kuò)張。

注：患者16，女，30歲，A：改良Gomori染色可見(jiàn)較多破碎紅纖維；B：COX染色可見(jiàn)破碎紅纖維氧化酶活性消失；C：患者29，男，7歲，SDH染色可見(jiàn)大量破碎藍(lán)纖維(黃箭頭)和SSV現(xiàn)象(紅箭頭)(×200)

注： A：線(xiàn)粒體數(shù)量增多、體積變大、腫脹、線(xiàn)粒體嵴紊亂；B:線(xiàn)粒體內(nèi)大量結(jié)晶樣包涵體呈“停車(chē)場(chǎng)”樣排列(×10000)

3 討 論

肌肉病理對(duì)MELAS綜合征具有十分重要的診斷價(jià)值。本研究采用多種染色方法來(lái)觀察MELAS綜合征的病理改變，每種染色方法都有自己的特征。光鏡下HE染色可見(jiàn)肌纖維大小不一，部分肌纖維變性、壞死、萎縮，與部分患者的肌酸激酶和乳酸脫氫酶升高相關(guān)。破碎紅纖維(RRF)是指肌纖維內(nèi)尤其是肌纖維膜下異常聚集的線(xiàn)粒體在改良Gomori染色上呈紅色且有破碎感，它的發(fā)生是由于線(xiàn)粒體功能障礙導(dǎo)致細(xì)胞能量供應(yīng)不足、線(xiàn)粒體代償性增生以及大量聚集。研究報(bào)道80%～100%的MELAS綜合征患者肌肉活檢病理可以看到RRF[1]。本研究中75.8%(25/33)患者改良Gomori染色可見(jiàn)到大量典型的RRF，與既往研究基本一致[2]。但是，RRF并非線(xiàn)粒體病的特征性改變，RRF還可見(jiàn)于肌營(yíng)養(yǎng)不良癥、多發(fā)性肌炎、包涵體肌炎、肌原纖維病、脂質(zhì)沉積性肌病、中央軸空病和50以上的健康人等[3～5]。有學(xué)者認(rèn)為RRF出現(xiàn)率大于4%才能診斷為線(xiàn)粒體病[6]，本研究也以RRF出現(xiàn)率大于4%為診斷標(biāo)準(zhǔn)。但是，肌肉活檢病理未發(fā)現(xiàn)RRF并不能排除MELAS，因?yàn)榧∪饣顧z取材具有局限性,RRF的分布具有隨機(jī)性。

酶學(xué)染色發(fā)現(xiàn)RRF的敏感性更高，本組研究酶學(xué)染色方法主要為NADH、SDH和COX染色。本組病例中78.9%(26/33)患者NADH染色可見(jiàn)破碎紅纖維，氧化酶活性增高，NADH是線(xiàn)粒體代謝過(guò)程中重要的酶，所以在異常線(xiàn)粒體聚集的肌纖維中表現(xiàn)明顯。肌纖維內(nèi)或者肌纖維膜下異常聚集的線(xiàn)粒體在SDH染色上呈藍(lán)色，故稱(chēng)為破碎藍(lán)纖維(ragged-blue fibers，RBF)。本組研究中84.8%(28/33)患者SDH染色可見(jiàn)到大量典型的RBF，氧化酶活性明顯增高，且RBF出現(xiàn)率較高，大約為10%，部分患者RBF的出現(xiàn)率高達(dá)30%，可見(jiàn)SDH染色發(fā)現(xiàn)異常線(xiàn)粒體的敏感性更高。此外，78.9%(26/33)患者見(jiàn)到肌間小動(dòng)脈血管壁深染，即SSV現(xiàn)象，其中2例未見(jiàn)RRF和RBF，后經(jīng)基因檢測(cè)確診為MELAS綜合征，說(shuō)明SSV現(xiàn)象是MELAS綜合征肌肉病理的一個(gè)重要特點(diǎn)，SSV現(xiàn)象與RRF、RBF具有同等的診斷意義。Bennett等[7]報(bào)道大約85%的MELAS綜合征患者出現(xiàn)SSV現(xiàn)象。SSV現(xiàn)象提示小動(dòng)脈平滑肌的線(xiàn)粒體異常，有報(bào)道認(rèn)為SSV不僅存在于肌肉小動(dòng)脈，也存在于腦小動(dòng)脈血管，可使腦動(dòng)脈血管壁的通透性增加而導(dǎo)致卒中樣發(fā)作[8,9]。COX是線(xiàn)粒體代謝過(guò)程中必不可少的一種酶，本組研究中66.7%(22/33)患者COX染色可見(jiàn)氧化酶活性消失或減低，即COX陰性肌纖維，這是MELAS綜合征肌肉病理的另外一個(gè)重要特點(diǎn)。

糖原累積癥、脂質(zhì)沉積性肌病和線(xiàn)粒體病是最常見(jiàn)的代謝性肌病，糖原、脂質(zhì)和線(xiàn)粒體共同參與細(xì)胞能量代謝[10,11]。本組研究中，45.5%(15/33)患者PAS染色顯示破碎紅纖維深染，提示糖原成分增多，說(shuō)明線(xiàn)粒體代謝異常時(shí)糖原代謝也存在障礙。本組研究發(fā)現(xiàn)72.7%(24/33)患者ORO染色發(fā)現(xiàn)較多非破碎紅纖維的肌纖維內(nèi)脂肪成分增多，其中破碎紅纖維內(nèi)脂肪成分明顯增多，提示MELAS綜合征的肌纖維內(nèi)脂質(zhì)異常堆積，會(huì)影響線(xiàn)粒體內(nèi)某些酶的功能，也是肌肉不耐受疲勞的一個(gè)原因。此外，肌纖維內(nèi)脂質(zhì)增加明顯者還應(yīng)注意與脂質(zhì)沉積性肌病相鑒別。

電鏡能夠十分清晰地看到肌纖維的微觀結(jié)構(gòu)，能夠更好地觀察線(xiàn)粒體的異常。本組15例MELAS綜合征患者電鏡下均可見(jiàn)到線(xiàn)粒體內(nèi)結(jié)晶樣包涵體呈“停車(chē)場(chǎng)”樣排列，是MELAS綜合征的典型特征。結(jié)晶樣包涵體的主要成分為線(xiàn)粒體肌酸激酶，其形成主要是因?yàn)榫€(xiàn)粒體ATP產(chǎn)生減少，線(xiàn)粒體肌酸激酶的功能發(fā)生代償而表達(dá)過(guò)度、酶活性降低而堆積的結(jié)果。線(xiàn)粒體肌酸激酶以二聚體及八聚體兩種形式存在，在一定條件下兩者可以相互轉(zhuǎn)化，pH較低時(shí)主要以八聚體的形式存在[12]。MELAS綜合征患者線(xiàn)粒體產(chǎn)生ATP不足，無(wú)氧酵解增加，產(chǎn)生大量的乳酸和H+，pH值降低，二聚體向八聚體轉(zhuǎn)化增多，促進(jìn)了結(jié)晶樣包涵體的形成。此外，結(jié)晶樣包涵體是線(xiàn)粒體損傷不可逆性的標(biāo)志[13]。MELAS綜合征患者電鏡下線(xiàn)粒體數(shù)量增多、體積增大、腫脹，線(xiàn)粒體腫脹可能和線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mitochondrial permeablity transition pore，mPTP)有關(guān)。線(xiàn)粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(mPTP)是位于線(xiàn)粒體內(nèi)膜與外膜之間的一組通道蛋白復(fù)合體，pH下降、鈣超載和過(guò)量的活性氧都可使mPTP過(guò)度開(kāi)放，從而導(dǎo)致線(xiàn)粒體基質(zhì)的內(nèi)滲透壓增高，引起線(xiàn)粒體腫脹[14]。總之，電鏡發(fā)現(xiàn)線(xiàn)粒體的異常比肌肉病理更加敏感，但是，由于電鏡取材較少，而且再經(jīng)過(guò)超薄切片，電鏡正常者并不能排除MELAS綜合征。

綜上所述，破碎紅纖維(RRF)、SSV現(xiàn)象和COX陰性肌纖維是MELAS綜合征主要的肌肉病理改變。SDH染色是發(fā)現(xiàn)破碎紅纖維最敏感的方法，SSV現(xiàn)象可以是MELAS綜合征唯一的肌肉病理改變，具有診斷價(jià)值。電鏡下線(xiàn)粒體數(shù)量增多、體積增大、嵴結(jié)構(gòu)紊亂，結(jié)晶樣包涵體呈“停車(chē)場(chǎng)”樣排列是MELAS綜合征的典型改變。充分認(rèn)識(shí)MELAS綜合征的肌肉病理和電鏡特征，有利于提高M(jìn)ELAS綜合征的診斷，減少漏診和誤診。