卡托普利通過調控lncRNA CHRF表達對帕金森病模型細胞損傷的影響

和曉春，邱 娟，常 蕾，劉偉芬，李祿輝

(1 河南能源焦煤中央醫院西藥房，焦作 454000；2 河南能源焦煤中央醫院病理科，焦作 454000；3 河南應用技術職業學院制藥工程學院，鄭州 450042)

帕金森病(parkinson’s disease，PD)是一種老年人常見的神經退行性疾病，認知功能障礙是其臨床主要特征，該疾病嚴重影響患者生活質量[1]。PD發病機制復雜，線粒體功能障礙、氧化應激、神經炎性反應、凋亡等均與其發病相關[2]。研究其具體的發病機制，有針對性的治療對延緩PD進展具有重要意義。目前主要是通過藥物延緩PD的發展，開發保護神經的新藥有利于提高PD患者的生活質量，也是今后PD藥物治療的研究方向[3]。卡托普利(captopril，Cap)是一種血管緊張素轉換酶抑制劑，常用于治療高血壓。研究報道，卡托普利可不同程度的改善血管緊張素Ⅱ(angiotensinⅡ，AngⅡ)對PC12細胞的抑制作用，并減緩細胞衰老[4]。卡托普利在帕金森病動物模型中可保護黑紋狀體多巴胺神經元免受損傷[5]。Cap還可增強抗氧化應激能力，減輕肝細胞脂肪變性及炎癥反應，對非酒精性脂肪肝有一定的防治作用[6]。然而，Cap對帕金森模型細胞凋亡和氧化應激的影響及其機制尚不清楚。研究表明，lncRNA在精神相關疾病中起重要作用[7]。心肌肥大相關因子(cardiac hypertrophy related factors，CHRF)上調表達加重了白細胞介素6(interleukin-6，IL-6)誘導的ATDC5細胞炎癥性損傷[8]。CHRF體內敲除可明顯預防缺血性損傷，并減輕神經功能障礙[9]。說明CHRF可調控細胞的炎癥反應，且與神經功能障礙有關。本實驗通過用1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-methyl-4-phenylpy ridinium ion，MPP+)誘導SK-N-SH細胞建立PD細胞模型，研究Cap對帕金森模型細胞凋亡和氧化應激的影響及其機制是否與CHRF有關。

1 材料與方法

1.1 材料

SK-N-SH細胞購自武漢普賽諾生命科技有限公司；胎牛血清、DMEM培養基購自美國Sigma公司；青霉素-鏈霉素雙抗購自上海素爾生物科技有限公司；1-甲基-4-苯基吡啶離子(1-Methyl-4-phenylpy ridinium ion，MPP+)購自北京謹明生物科技有限公司；卡托普利注射液(生產廠家：常州制藥廠有限公司，生產批號：國藥準字H10970294，規格：1 ml∶25 mg)；丙二醛(malonaldehyde，MDA)試劑盒、谷胱甘肽(glutathione，GSH)試劑盒購自南京建成生物工程研究所；膜聯蛋白V-異硫氰酸熒光素/碘化丙錠(Annexin V-FITC/PI)試劑盒購自江蘇凱基生物技術股份有限公司；二辛可寧酸(bicinchoninic acid，BCA)試劑盒、RIPA蛋白裂解液購自碧云天生物技術研究所；LipofectamineTM2000轉染試劑購自美國Invitrogen公司；FACSCanto Ⅱ流式細胞儀購自美國 Bio-Rad公司。

1.2 細胞培養

SK-N-SH細胞用含10%胎牛血清和1%青霉素-鏈霉素雙抗的DMEM培養液在37 ℃、5% CO2條件下培養，每周換液3次，待細胞融合至90%左右時，進行消化傳代，取對數生長期細胞進行實驗。

1.3 細胞處理與分組

用100 μmol/L的MPP+處理SK-N-SH細胞建立帕金森病模型，記為MPP+組；用濃度分別為0.5、5、50 μg/ml的Cap處理SK-N-SH細胞24 h后再用100 μmol/L的MPP+處理，作為Cap低、中、高濃度組(MPP++Cap-L組、MPP++Cap-M組、MPP++Cap-H組)；未經任何處理的細胞作為對照組(Con)；同時以50 μmol/L司來吉蘭(SEL)和100 μM的MPP+處理作為陽性對照藥組(MPP++SEL)。將si-NC、si-CHRF轉染至SK-N-SH細胞中再用100 μmol/L的MPP+處理，記為MPP++si-NC組、MPP++si-CHRF組。將si-CHRF、pcDNA、pcDNA-CHRF轉染至SK-N-SH細胞后用50 μg/ml Cap和100 μmol/L MPP+處理，記為MPP++Cap+si-CHRF組、MPP++Cap+pcDNA組、MPP++Cap+pcDNA-CHRF組。

1.4 丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)含量檢測

細胞培養48 h后收集各組細胞及細胞培養上清液，用MDA試劑盒、GSH試劑盒分別檢測MDA、GSH含量，按試劑盒說明書進行操作。

1.5 流式細胞術檢測細胞凋亡

細胞培養48 h后用預冷的磷酸鹽緩沖液(PBS)漂洗2次，與500 μl的結合緩沖液混勻。先加入 10 μl Annexin V-FITC，再加入5 μl碘化丙錠(PI)，混勻后避光孵育10 min。用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。每組設3個復孔，實驗重復3次。

1.6 蛋白質印跡(western blot)法檢測Bcl-2、Bax蛋白表達

細胞培養48 h后提取總蛋白，BCA試劑盒測定蛋白濃度。將蛋白樣品進行聚丙烯酰胺凝膠電泳后轉至聚偏二氟乙烯膜上，用5%脫脂奶粉室溫封閉 1 h，再分別加入一抗(1∶1000)，4 ℃孵育過夜，TBST洗膜；加入二抗(1∶2000)室溫孵育90 min，TBST洗滌；用ECL發光液顯影，用ChemiDoc XRS+系統成像，用Quantity One凝膠分析軟件測定各組蛋白條帶的灰度值，蛋白相對表達水平=目的條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值。每個蛋白樣品設3個重復。

1.7 實時熒光定量PCR(real-time quantitative PCR，RT-qPCR)法檢測CHRF表達水平

各組細胞培養48 h，提取總RNA，反轉錄成 cDNA，按照熒光定量試劑盒說明進行PCR，每個樣品設3個重復，循環條件為95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，60 ℃ 30 s；72 ℃ 30 s，共40個循環；60 ℃延長 5 min。相對表達量用2-△△Ct法計算。CHRF以GAPDH為內參，CHRF上游引物序列：5’-GTGTTAGCCACCACTACCCAGC-3’，下游引物序列：5’--CCACAGCCCACAACTTTCAAG-3’；GAPDH上游引物序列：5’-CCCCATACACAGTGTTAGCC-3’，下游引物序列：5’-GAGTGATTTTCCCGTCC-3’；引物由上海生工生物工程公司合成。

1.8 統計學分析

2 結果

2.1 Cap對MPP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激的影響

與對照組相比，MPP+組SK-N-SH細胞中MDA含量升高，GSH含量降低(P<0.05)；與MPP+組相比，卡托普利低、中、高濃度組及陽性對照藥物組SK-N-SH細胞中MDA含量降低，GSH含量升高，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表1。

表1 卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞氧化應激的影響

2.2 Cap對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

與對照組相比，MPP+組SK-N-SH細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高(P<0.05)；與MPP+組相比，卡托普利低、中、高濃度組及陽性對照藥物組SK-N-SH細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見圖1和表2。

A：凋亡相關蛋白的表達；B：細胞凋亡流式圖圖1 卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

表2 卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

2.3 Cap對MPP+誘導SK-N-SH細胞中lncRNA CHRF表達的影響

與對照組相比，MPP+組CHRF表達水平升高(P<0.05)；與MPP+組相比，Cap低、中、高濃度組及陽性對照藥物組CHRF表達水平降低，且呈濃度依賴性(P<0.05)。見表3。

表3 卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞中lncRNA CHRF表達的影響

2.4 抑制lncRNA CHRF表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的影響

與MPP++si-NC組相比，MPP++si-CHRF組CHRF表達水平降低，凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，MDA含量降低，GSH含量升高(P<0.05)；與MPP++si-CHRF組相比，MPP++Cap+si-CHRF組CHRF表達水平降低，凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，MDA含量降低，GSH含量升高(P<0.05)。見圖2和表4。

A:凋亡相關蛋白的表達；B:細胞凋亡流式圖圖2 抑制lncRNA CHRF表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的影響

表4 抑制lncRNA CHRF表達對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的影響

2.5 lncRNA CHRF過表達逆轉了Cap(50 μg/ml)對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的作用

與MPP+組相比，MPP++Cap組CHRF表達水平降低，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低，MDA含量降低，GSH含量升高(P<0.05)；與MPP++Cap+pcDNA組相比，MPP++Cap+pcDNA-CHRF組CHRF表達水平升高，細胞凋亡率升高，Bcl-2表達水平降低，Bax表達水平升高，MDA含量升高，GSH含量降低(P<0.05)。見圖3和表5。

表5 lncRNA CHRF過表達逆轉了卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞損傷的作用

A:凋亡相關蛋白的表達；B:細胞凋亡流式圖圖3 lncRNA CHRF過表達逆轉了卡托普利對MPP+誘導SK-N-SH細胞凋亡的作用

3 討論

帕金森病是常發于老年人的一種慢性進行性疾病，隨著人口的老齡化，其發病率逐漸升高[10]。氧化應激造成的氧化性損傷可促進多巴胺能神經元凋亡，因此氧化應激在PD發展中起重要作用，抗氧化應激在一定程度上可治療PD[11]。本實驗結果顯示，MPP+誘導的SK-N-SH細胞中丙二醛(malonaldehyde，MDA)含量升高，谷胱甘肽(Glutathione，GSH)含量降低，且細胞凋亡率升高。表明MPP+可誘導SK-N-SH細胞氧化應激的產生以及促進細胞凋亡。

研究報道，Cap可下調活性氧簇(reactive oxygen species，ROS)水平和MMP-9的表達，并減輕腦水腫和改善神經功能[12]。Cap通過抑制自噬和激活腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activatedprotein kinase，AMPK)可減弱病毒肽PrP介導的神經元凋亡[13]。Cap對局灶性腦缺血具有神經保護作用[14]。Cap通過腦組織氧化損傷改善了脂多糖誘導的大鼠學習和記憶障礙[15]。Cap對人臍靜脈內皮細胞氧化損傷具有保護作用，可提高其活力，增強超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)活性，降低MDA含量,呈現一定的濃度依賴性[16]。本實驗結果顯示，Cap處理后，MPP+誘導的SK-N-SH細胞中MDA含量降低，GSH含量升高，細胞凋亡率降低，Bcl-2表達水平升高，Bax表達水平降低。表明Cap可抑制氧化應激的產生以及抑制細胞凋亡，Cap對MPP+誘導的SK-N-SH細胞損傷具有保護作用。

研究表明，lncRNA可參與調控細胞凋亡和氧化應激水平，如沉默CHRF可增加脂多糖誘導的H9c2細胞活性、抑制細胞凋亡、抑制ROS的產生和炎性因子的表達，可保護H9c2細胞免受脂多糖誘導的損傷[17]。纈沙坦通過下調CHRF減輕心力衰竭過程中的心臟功能障礙和損傷[18]。以上結果表明CHRF與細胞凋亡，氧化水平及炎癥反應均相關。本實驗結果顯示，MPP+誘導SK-N-SH細胞中CHRF表達水平升高；抑制CHRF表達，抑制了MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡和氧化應激。Cap處理后，CHRF表達水平降低；卡托普利處理的同時抑制CHRF表達，更顯著地抑制了MPP+誘導的SK-N-SH細胞凋亡和氧化應激；且CHRF過表達逆轉了Cap對MPP+誘導的SK-N-SH細胞損傷的保護作用。

綜上所述，Cap通過下調CHRF表達，可抑制MPP+誘導的SK-N-SH細胞損傷。