痘苗病毒致炎兔皮提取物對腦缺血再灌注腦損傷大鼠凋亡和神經炎癥的影響

陳小平，王明洋，馬登磊，龔詩立，張麗，李雅莉，李林，胡朝英，張蘭

首都醫科大學宣武醫院藥學部，國家老年疾病臨床醫學研究中心，神經變性病教育部重點實驗室，北京市神經藥物工程研究中心，北京市100053

缺血性腦卒中是一種復雜的腦血管疾病，是目前危害人類健康的主要疾病之一[1]。中國是腦卒中發病率最高的國家之一[2]。缺血性腦卒中涉及多個病理過程，如炎癥反應、細胞凋亡、興奮性毒性和氧化應激等。其中細胞凋亡導致神經元數量減少，大腦功能受損[3?4]；在腦組織恢復血流灌注時，也將產生過多的活性物質和炎癥因子，引發炎癥反應，加劇梗死中心損傷，并導致腦缺血再灌注損傷[5?7]。通過抑制炎癥誘導的細胞凋亡，對該病治療有重要意義。

痘苗病毒致炎兔皮提取物(analgecine,AGC)是從牛痘病毒致炎的日本大耳白兔皮膚提取的一種生物活性制劑，含有多種多肽、氨基酸、核苷酸等物質[8]，用于頸肩腕綜合征[9]、腰痛[10]、冷感、麻木等癥狀的緩解和癥狀性神經痛[11]，臨床應用已近70 年[12]。最近研究表明，AGC 有抗炎鎮痛[12]、神經營養和保護作用[13?14]。本研究采用Sprague?Dawley 大鼠大腦中動脈缺血(middle cerebral artery occlusion,MCAO)再灌注模型，探索AGC的治療作用以及其可能的藥理機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

SPF 級Sprague?Dawley大鼠61只，體質量260～300 g，購自維通利華有限公司，飼養于首都醫科大學宣武醫院實驗動物室屏障樓，室溫20～24 ℃，濕度50%～70%，12 h光照，自由進食、進水。

所有操作符合保護動物福利倫理標準。

1.2 主要試劑和儀器

AGC：批號Y20180505，威世藥業(如皋)有限公司。MCAO 線栓：西濃公司。熱休克蛋白70 (heat shock proteins 70,HSP70)和Bcl?2 一 抗：ABCAM 公司。Bax 一抗：CST 公司。辣根酶標記山羊抗兔IgG、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG、膠質纖維酸性蛋白(glial fibrillary acidic protein,GFAP)、離子鈣結合蛋白(ion?ized calcium binding adapter molecule 1,Iba1)、二步法檢測試劑盒、一抗山羊血清(貨號ZLI?9021)、DAB 顯色試劑盒：北京中杉金橋生物技術有限公司。乙二醇：上海麥克林生化科技有限公司。丙三醇：北京化工廠有限責任公司。

BH?2光學顯微鏡： 日本OLYMPUS公司。BS210S 電子天平：北京賽多利斯天平有限公司。CM1950冰凍切片機：德國LECIA公司。

1.3 動物分組、造模和給藥

大鼠分為假手術組11 只，假手術給藥組11 只，模型組20只和模型給藥組19只。

模型組和模型給藥組稱重后，10%水合氯醛3.3～3.5 ml/kg 腹腔注射麻醉，仰臥位固定，備皮，頸部正中切口，分離右頸總動脈；于頸總動脈分叉處插入線拴至大腦前動脈近端，結扎大腦中動脈，并用黑色記號筆在線栓上標記；固定線栓和頸內動脈，縫合切口。假手術組和假手術給藥組分離右頸總動脈后直接縫合切口。

大鼠術后置于放有棉花的鼠籠中保溫，1.5 h后拔出線栓，解開結扎手術線。大鼠清醒后出現左側肢體癱瘓，站立不穩，提尾時向一側轉圈，判定為造模成功。模型組和模型給藥組各有2 只造模不成功，予以剔除。

再灌注3 h 后，各給藥組尾靜脈注射AGC 20 U/kg，假手術組和模型組尾靜脈注射等體積生理鹽水，以后每天1 次。再灌注48 h 后，每組4 只大鼠取材，其余繼續給藥至第7天。

1.4 抓握牽引實驗[15]

給藥第7 天，在距離地面40 cm 左右放置直徑1 mm、長60 cm的鋼絲繩，鋼絲繩下放置泡沫墊避免跌傷。將大鼠前爪置于鋼絲繩上，記錄松手后至大鼠跌落的時間。評分標準：0 分，無法抓握；1 分，抓握≤10 s；2 分，10 ＜～20 s；3 分，20 ＜～30 s；4 分：30 ＜～60 s；5分，60 ＜～90 s；6分，90 ＜～120 s。

1.5 Western blotting

再灌注48 h，每組取4只，同法麻醉，斷頭取腦。冰上分離左右皮質，凍存管中液氮凍存，儲存于-80 ℃冰箱。提取各組皮質缺血半暗帶區組織蛋白，BCA 定量，等體積加入5×蛋白上樣緩沖液，95 ℃5 min 備用或-20 ℃儲存。蛋白樣本電泳、電轉，5%脫脂奶粉搖床室溫封閉1 h，加入HSP70 (1∶1000)、Bcl?2(1∶1000)、Bax(1∶1000)和β?actin(1∶2000)一抗，4 ℃過夜。TBST洗3次，加入辣根酶標記山羊抗兔IgG (1∶2000)、辣根酶標記山羊抗小鼠IgG (1∶2000)二抗，室溫孵育1 h，TBST 洗3 次。暗室內滴加發光液，化學發光凝膠成像系統掃描并分析目標條帶凈光密度值，用AlphaView SA 軟件計算目的蛋白條帶灰度值，并計算與β?actin的比值。

1.6 免疫組化染色

完成抓握牽引實驗后，每組取4 只大鼠，同法麻醉，開胸，完全暴露心臟，注射器針頭插入左心室心尖，在心臟右心耳處剪一小口；緩慢推動注射器注入蒸餾水，待右心耳流出的液體不再有血液時，換4%多聚甲醛(pH=7.4)繼續灌注至大鼠四肢僵直。開顱取腦，4%多聚甲醛固定，4 ℃暫存；固定24 h后，冰凍切片，厚30 μm，凍存液(0.01 mol/L 磷酸鹽緩沖液∶乙二醇∶丙三醇=2∶1∶1)中-20 ℃儲存。

取出腦片，置PBS 中平衡30 min，自然冷卻至室溫，PBS 洗3 遍；3%H2O2室溫避光孵育10 min；PBS洗3 遍；滴加10%山羊血清封閉液37 ℃孵育1 h。加GFAP(1∶500)和Iba1 (1∶200)一抗，4 ℃過夜。PBS洗3 遍，滴加試劑2，37 ℃孵育20 min；PBS 洗3 遍，滴加試劑3，37 ℃孵育20 min；PBS 洗3 遍。DAB 顯色1 min，自來水終止；裱片，晾干，梯度酒精脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Image?J 軟件計算Iba1和GFAP陽性面積。

1.7 統計學分析

采用GraphPad Prism 8.0 軟件進行數據分析。計量資料用()表示，多組間樣本比較采用單因素方差分析。顯著性水平α=0.05。

2 結果

2.1 抓握牽引實驗

與假手術組相比，模型組抓握牽引時間顯著降低(P＜0.001)；與模型組相比，模型給藥組抓握牽引時間明顯升高(P＜0.01)。見表1。

表1 各組抓握牽引實驗評分

2.2 Western blotting

模型組HSP70、Bcl?2 和Bcl?2/Bax 較假手術組降低(P＜0.05)，模型給藥組較模型組明顯升高(P＜0.01)。見圖1、表2。

2.3 免疫組化染色

圖1 各組皮質Western blotting結果

假手術組和假手術給藥組星形膠質細胞和小膠質細胞形態正常且分布均勻；模型組星形膠質細胞和小膠質細胞活化明顯，且呈團塊狀分布，Iba1 和GFAP陽性面積顯著增加(P＜0.001)；與模型組相比，模型給藥組星形膠質細胞和小膠質細胞活化程度明顯降低，GFAP 和Iba1 陽性面積均有所減少(P＜0.05)。見圖2、圖3、表3。

3 討論

腦缺血再灌注損傷引起細胞凋亡、炎癥反應和神經元變性，導致神經功能損傷[16?17]。凋亡是神經元丟失的主要原因之一，而星形膠質細胞和小膠質細胞在腦缺血缺氧等刺激后被激活。我們前期研究顯示[18]，腦缺血再灌注損傷后第7 天，星形膠質細胞仍處于激活狀態，引發神經炎癥?；罨哪z質細胞釋放大量促炎癥因子，進一步激活下游炎癥信號通路，導致炎癥發生，最終導致腦損傷[19?21]。

腦缺血再灌注損傷后出現細胞凋亡，大量神經元損傷[22]。Bcl?2 蛋白家族包括Bax 等促凋亡蛋白和Bcl?2 等抗凋亡蛋白，二者比例決定細胞在受到凋亡信號刺激后是否發生凋亡[23]。Bcl?2 通過穩定線粒體膜電位、抑制氧自由基產生、抑制Ca2+內流、阻止p53 基因表達產物進入胞核等多種途徑，抑制細胞凋亡發生[24?26]。再灌注24～48 h時凋亡最嚴重，是研究抗凋亡藥物的理想時段[18]。本研究顯示，缺血再灌注損傷后48 h，AGC 能顯著增加MCAO 大鼠腦內Bcl?2 蛋白表達，使Bcl?2/Bax 比例增高，從而抑制細胞凋亡，減少損傷，維持神經元正常功能。

表2 各組HSP70、Bcl-2和Bax表達

圖2 各組皮質GFAP表達(免疫組化染色,×200)

圖3 各組皮質Iba1表達(免疫組化染色,×200)

表3 各組GFAP和Iba1陽性面積(%)

HSP70 是一種細胞保護蛋白。細胞受到外源性刺激時，可通過分泌HSP70，提高細胞抵抗力[27]。HSP70 還可增加Bcl?2 的表達，對缺血性腦損傷起保護作用[28?29]。本研究顯示，AGC 能促進MCAO 大鼠HSP70 分泌，抵抗腦損傷；還可通過調控Bcl?2 蛋白的表達，間接抑制細胞凋亡。

Iba1 是小膠質細胞標記物。小膠質細胞活化釋放許多細胞因子、補體和炎性介質[30]。GFAP 在星形膠質細胞特異性表達[31]。在腦缺血后，活化的小膠質細胞誘導神經毒性反應性星形膠質細胞活化，引發神經炎癥，導致神經損傷，引起神經元死亡[19,32]。星形膠質細胞和小膠質細胞活化后，釋放細胞因子，活化單核巨噬細胞，對神經元有較強的細胞毒性，使神經元細胞凋亡機制不可逆啟動，從而加重腦缺血區損傷[33?34]。本研究顯示，AGC 可通過抑制星形膠質細胞和小膠質細胞活化，抑制腦缺血再灌注后炎癥反應，進一步減少腦損傷。

綜上所述，本研究顯示，AGC可促進腦缺血再灌注大鼠運動功能恢復，對缺血再灌注損傷有較好的保護作用，可能涉及抑制細胞凋亡和神經炎癥。AGC對星形膠質細胞和小膠質細胞活化的抑制作用，為進一步研究AGC抗炎作用機制提供基礎。

利益沖突聲明：所有作者聲明不存在利益沖突。