北極狐Wnt3a基因CDS區克隆及生物信息學分析

王瑞寧，周瑞紅，趙子雅，馮碩，李可強，彭永東，李祥龍

(河北科技師范學院動物科技學院，河北 秦皇島 066004)

北極狐(Vulpeslagopus)絨毛稠密豐厚，針毛挺拔柔軟，毛皮板質薄而結實并富有彈性，御寒力強，雍容高雅，號稱“軟黃金”。狐皮目前已經成為國際裘皮貿易的三大支柱產品之一，是制裘工業的高檔原料，在毛皮動物產業中占有舉足輕重的地位。北極狐作為重要的毛皮動物，其毛色豐富，是開展動物毛色研究的最佳材料，其中毛色作為影響狐皮品質最重要的性狀之一，是狐皮經濟價值關鍵因素[1]。

Wnt家族成員3a(wingless-type MMTV integration site family, member 3a，Wnt3a)是Wnt家族的重要成員之一，通過經典的Wnt/β-catenin信號通路參與細胞的增殖、分化、凋亡以及控制細胞的定位等過程[2]。Wnt3a在黑素細胞的發育中起著重要的作用，它可以促進神經嵴細胞向色素細胞發育，如果缺乏Wnt3a和Wnt1這2種蛋白，神經嵴細胞就會發育成神經元細胞而不是黑素細胞[3]。Wnt3a對黑色素細胞的分化也起到了調控作用，它可以促進小眼畸形相關轉錄因子(MITF)的表達，進而促進黑素母細胞分化成黑色素細胞[4]。Guo等[5]也發現，Wnt3a通過上調MITF及其下游基因酪氨酸酶和酪氨酸相關蛋白1(TRP1)，在降低黑色素細胞增殖的同時，增加黑色素合成。Wnt蛋白對黑色素的調控作用一般是通過結合細胞膜上的脂蛋白受體相關蛋白5/6(LRP-5/6)和卷曲蛋白(frizzled)受體來實現的。它們形成的復合物活化胞內的散亂蛋白(dishevelled)，進而抑制糖原合成酶激酶-β(GSK-β)的活性，增加胞漿內具有穩定結構的β-catenin的量，β-catenin聚集后結合TCF/LEF家族蛋白形成轉錄復合物，再與MITF基因的啟動子結合，從而激活MITF基因的表達，參與黑色素細胞的分化、黑色素生成等[6-7]。在不同毛色的羊駝皮膚組織中，Wnt3a的表達量也具有顯著差異[8]。除此之外，Wnt3a基因及其相關信號通路與多種疾病的發生相關，如先天性巨結腸病、結腸癌、肝癌、慢性牙周炎等[9-12]。因此對于Wnt3a基因及其相關信號通路的研究近幾年成為熱點。

關于北極狐Wnt3a基因和Wnt3a基因的生物信息學分析有關的研究尚未見報道，而本研究利用反轉錄PCR技術(RT-PCR)，成功擴增了北極狐Wnt3a基因CDS區序列，然后構建到了pMD 18-T載體中，并對北極狐Wnt3a基因CDS區進行了生物信息學分析，為今后北極狐毛色調控機制和Wnt3a基因及相關信號通路的研究奠定了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料與試劑

北極狐為河北科技師范學院動物科技學院飼養，240日齡時，選擇雄性北極狐屠宰后迅速取背部皮膚組織，液氮凍存30 min后，存放于-80 ℃冰箱中。

試驗用到的反轉錄試劑盒、pMDTM18-T Vector Cloning Kit、PrimeSTAR Max DNA Polymerase、DNA Marker、氨芐青霉素購自TaKaRa公司；感受態細胞DH5α購自博邁德生物有限公司；胰蛋白胨、酵母粉、瓊脂糖、TRIzol試劑購自Thermo Fisher Scientific公司；2×EsTaqMasterMix(Dye)購于康為世紀生物有限公司；DNA膠回收試劑盒購自OMEGA公司；質粒小提試劑盒購自上海生工生物工程有限公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 北極狐皮膚組織總RNA的提取及反轉錄

取北極狐皮膚組織，按照TRIzol法提取總RNA，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA質量，并用超微量分光光度計檢測其濃度。參照反轉錄試劑盒說明書，以Oligo(dT)為引物，將RNA反轉錄為cDNA，然后存放于-70 ℃冰箱保存。

1.2.2 Wnt3a基因CDS區的擴增

從NCBI中找到了與北極狐同為犬科的澳洲野狗Wnt3a基因cDNA的序列(登錄號XM_025454916.1)，利用Primer 5.0軟件進行引物設計。上游引物(F)為：5′-CGGTGCTCTCGGGGTGGAC-3′，下游引物(R)為：5′-CGCGCTACTTGCAGGTGT-3′，預計擴增片段大小為1 112 bp。引物交由北京華大基因有限公司合成。PCR反應體系為50 μL：PrimeSTAR Max DNA Premix(2×)25 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 22 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；98 ℃變性10 s，58 ℃退火8 s，72 ℃延伸10 s，共33個循環；72 ℃終延伸5 min；12 ℃保存。之后將所有PCR產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。

1.2.3 目的片段的克隆與鑒定

由于PCR擴增片段為平末端，構建至pMD18-T載體時，需要先對片段末端加A，具體方法為：取PCR回收產物24.9 μL，加入TaqDNA聚合酶0.6 μL，dNTPs 1.5 μL，10×PCR Buffer 3 μL，放在PCR儀中72 ℃修飾15 min。然后將產物用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳，回收目的片段。將目的片段與pMD18-T載體于PCR儀中16 ℃連接1 h。將連接產物轉化至DH5α感受態細胞中，37 ℃搖床培養1.5 h。之后，取100 μL菌液涂在含有Amp的LB平板上，37 ℃培養12 h。挑取白色單菌落于1.5 mL離心管中，加入1 mL LB液體培養基(含Amp)，37 ℃搖床培養5 h后，進行PCR鑒定。PCR反應體系為20 μL：2×EsTaqMasterMix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，菌液1 μL，ddH2O 8 μL。PCR反應條件為：95 ℃預變性5 min；95 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共33個循環；72 ℃終延伸5 min；12 ℃保存。擴增產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，陽性菌液送北京華大基因有限公司測序。

1.3 生物信息學分析

利用NCBI中OFR Finder程序(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)對北極狐Wnt3a基因核苷酸序列進行開放閱讀框分析；利用Protparam(http://www.expasy.org/tools/protparam.html)、Protscale(http://web.expasy.org/protscale/)分析蛋白質理化性質；利用GOR4(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_gor4.html)、SWISS-MODEL(https://swissmodel.expasy.org/interactive)對蛋白質二級結構和三級結構進行分析；使用TMHMM Server v.2.0(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)分析蛋白質跨膜結構；利用PSORT Ⅱ(https://psort.hgc.jp/form2.html)分析蛋白質亞細胞定位；利用NetPhos 3.1 Server(http://www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/)對蛋白質磷酸化位點進行預測；使用SignalP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對蛋白質信號肽進行分析；除了澳洲野犬外，又從NCBI中找到了家犬(XM_539327.5)、綿羊(XM_027969327.1)、人(XM_011544319.3)、小鼠(NM_009522.2)、馬(XM_023618338.1)、雞(NM_001171601.1)、雪貂(XM_003123621.4)的Wnt3a基因序列，利用MegAlign和MEGA 7軟件進行同源性分析和系統進化樹的構建。

2 結果與分析

2.1 Wnt3a基因克隆載體的構建

取北極狐Wnt3a基因PCR產物，用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測后，發現目的條帶大小與之前預測的1 112 bp的大小相吻合(圖1A)。通過切膠回收和末端修飾后，構建至pMD18-T載體，經過轉化后挑取單菌落進行PCR，然后用1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(圖1B)，選擇陽性菌液送公司進行測序。將測序結果進行拼接校正后，獲得了北極狐Wnt3a基因完整的CDS區序列(圖2)。

M.DL2000 DNA Marker；1.Wnt3a基因

圖2 北極狐Wnt3a基因核酸及氨基酸序列

2.2 北極狐Wnt3a基因核苷酸序列及氨基酸序列分析

利用NCBI中的ORF Finder對測序得到的北極狐Wnt3a基因核苷酸序列進行了開放閱讀框分析，得到了1條1 059 bp的ORF，其起始密碼子位于第49位，終止密碼子位于1 107位，共計編碼352個氨基酸。通過DNAman對序列分析發現，其核苷酸序列A、T、C、G含量分別為17.9%、16.4%、33.8%、31.8%。其編碼氨基酸組成及比例如表1所示，北極狐Wnt3a基因編碼蛋白由20種氨基酸組成，其中絲氨酸含量最高，達到9.09%。

表1 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白氨基酸組成

2.3 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白理化性質分析

利用ProtParam在線工具對北極狐Wnt3a基因編碼蛋白進行分析，得出其分子式為C1714H2626N506O506S31，相對分子質量為39 410.65，等電點為8.26，說明該蛋白為堿性蛋白質。當該蛋白所有的半胱氨酸殘基形成半胱氨酸時，其消光系數為68 880 mol/mL，對應的吸光值為1.748；當該蛋白所有的半胱氨酸殘基不能形成半胱氨酸時，其消光系數為67 380 mol/mL，對應的吸光值為1.710。在哺乳動物的網狀紅細胞中，該蛋白的半衰期為30 h。不穩定系數為50.26，說明該蛋白不穩定。脂溶指數為61.53，總平均親水性(GRAVY)為-0.385，說明該蛋白為親水性蛋白。該蛋白親水性分析如圖3所示，北極狐Wnt3a蛋白大部分氨基酸均屬于親水性氨基酸，因此總體顯示出親水性。

圖3 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白親水性分析

2.4 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白二級結構和三級結構的預測

利用GOR4在線分析工具對北極狐Wnt3a基因編碼蛋白的二級結構進行分析，得出其二級結構中大部分為無規卷曲，占比為51.7%，其次為β-片層和α-折疊，占比分別為27.56%和20.74%，且不存在其他二級結構(圖略)。使用SWISS-MODEL在線建模工具對北極狐Wnt3a蛋白進行三級結構預測，其主體結構較為復雜，與二級結構中預測到的存在大量的無規卷曲結果相一致(圖略)。

2.5 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白跨膜結構與亞細胞定位分析

利用TMHMM在線分析工具對北極狐Wnt3a基因編碼蛋白跨膜結構分析發現，該蛋白所有氨基酸均位于膜外(圖4)，所以推測該蛋白屬于膜外蛋白。通過使用PSORTⅡ對北極狐Wnt3a基因編碼蛋白進行亞細胞定位分析，預測出該蛋白定位于細胞質、細胞核、線粒體、細胞膜外、內質網和細胞骨架中，其占比分別為：30.4%、21.7%、21.7%、8.7%、8.7%、8.7%。

圖4 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白跨膜結構分析

2.6 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白磷酸化和信號肽分析

通過使用NetPhos 3.1 Server在線工具對北極狐Wnt3a基因氨基酸序列進行蛋白質磷酸化位點分析(圖5)，發現其中有22個絲氨酸、6個蘇氨酸、5個酪氨酸位點的預測值超過了臨界值。

圖5 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白磷酸化位點分析

利用SignalP 4.1在線工具對北極狐Wnt3a基因編碼蛋白的信號肽進行了分析(圖6)，從第19個氨基酸位點開始，之后的氨基酸的C值、Y值、S值突然降低，然后趨于平緩，推測該蛋白可能存在信號肽，且信號肽位于1～19位氨基酸位點，其切割位點位于第19個氨基酸處。

圖6 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白信號肽分析

2.7 北極狐Wnt3a基因編碼蛋白同源性與系統發育分析

從NCBI數據庫中下載了澳洲野犬、家犬、綿羊、人等9個物種的Wnt3a基因的mRNA序列，利用MegAlign和MEGA 7軟件對北極狐和這9個物種進行了Wnt3a基因的同源性分析(表2)和系統發育樹的構建(圖7)。從同源性分析來看，在這9個物種中，與北極狐親緣關系最近的是澳洲野犬，其相似度達到了99.7%，親緣關系最遠的是原雞，其相似度為75.2%。除此之外，家犬、綿羊、人、小鼠、馬、野豬、雪貂與北極狐的Wnt3a基因的相似度都在85%以上，由此可以得出Wnt3a基因具有較好的保守性。從系統發育樹來看，各物種間的親緣關系與物種分類基本一致，與北極狐進化關系最近的為澳洲野犬，其次為家犬，且它們同屬犬科；它們又與雪貂、野豬、綿羊、馬、人、小鼠同為一類，它們同屬于哺乳動物；而原雞作為卵生動物，與北極狐的進化關系最遠。

表2 10個物種Wnt3a基因同源性分析

圖7 10個物種Wnt3a基因系統發育樹

3 討論

近年來關于Wnt信號通路的研究成為一個熱門，其中的Wnt家族是一類富含半胱氨酸的分泌性糖蛋白，目前在人類中已經發現了該家族的成員19種，它們通過與細胞質基質及其特異性受體卷曲蛋白相互作用，激活下游的Wnt信號轉導通路[13]。Wnt3a所在的Wnt/β-catenin通路是經典的Wnt信號通路，是目前為止研究最多的Wnt信號通路[14]。Wnt3a除了與黑色素的生成有關外，還與包括癌癥在內的許多疾病的病因學和病理學密切相關[15-16]。目前關于Wnt3a基因的結構和功能的研究還未見報道。

本試驗通過利用RT-PCR的方法，成功克隆了北極狐Wnt3a基因，并經過測序分析得到了其完整的CDS區序列，其包含1 059個堿基，編碼352個氨基酸，其數量與NCBI中家犬和人的Wnt3a蛋白氨基酸含量存在差異。對其理化性質分析發現，該蛋白為堿性且不穩定的親水性蛋白。對北極狐Wnt3a蛋白的二級結構和三級結構分析發現，其中間存在著大量的無規卷曲，占比達到了51.7%，使得其三級結構呈現出復雜的立體結構。

通過進一步的分析發現，北極狐Wnt3a蛋白屬于膜外蛋白，其主要定位于細胞質、細胞核和線粒體中，與已往研究發現的Wnt3a蛋白作為一種分泌蛋白可以調控多種基因表達的說法一致[17]。磷酸化是蛋白質功能調節的重要機制，在蛋白質功能和活力的控制和調節中具有重要作用[18]。北極狐Wnt3a蛋白中存在33個蛋白磷酸化位點超過臨界值，說明這些位點可能會成為蛋白激酶磷酸化位點[8]。信號肽序列的作用是把蛋白質引導到細胞含不同膜結構的亞細胞器內[19]。在利用SignalP進行信號肽分析時，C值越高表示剪切位點的可能性越大，Y值最高點常作為最佳剪切位點，S值的低分和高分位置分別表示氨基酸位于成熟蛋白部位和信號肽部位[20]。北極狐Wnt3a蛋白蛋白存在信號肽結構，位于1～19位氨基酸位點，切割位點位于第19個氨基酸處。從同源性和系統發育分析來看，在北極狐與澳洲野犬、家犬、綿羊、人等9個物種的Wnt3a基因序列比較中，同樣作為犬科的澳洲野犬和家犬與北極狐親緣關系較近，且與其他幾個哺乳動物的同源性均達到了85%以上，而與卵生動物原雞親緣關系最遠，但也存在75.2%的同源性，由此說明了Wnt3a基因保守性較好，但是在哺乳動物和卵生動物之間可能存在較大的差異。

綜上所述，本研究成功克隆了北極狐Wnt3a基因的CDS區序列，并對其核苷酸和編碼氨基酸序列成分、理化性質進行了分析，同時還利用生物信息學的方法對北極狐Wnt3a基因編碼蛋白進行了二級結構、三級結構、跨膜結構、亞細胞定位、磷酸化位點、信號肽以及與其他8個物種間同源性和系統發育分析，為今后研究Wnt3a基因及相關通路提供了重要參考。