不同類型豬肌肉組織中代謝及線粒體功能相關(guān)蛋白分析

胡悅旻，許金蔓，彭玥晗，徐磊，鞠輝明

(揚(yáng)州大學(xué)獸醫(yī)學(xué)院/江蘇省動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 揚(yáng)州 225009)

豬肉是我國居民日常生活中最主要的消費(fèi)肉類，與人民生活密不可分，近年來提高豬肉生產(chǎn)效率，優(yōu)化豬肉品質(zhì)是養(yǎng)豬業(yè)的一大目標(biāo)。豬的產(chǎn)肉率與骨骼肌生長發(fā)育緊密相關(guān)，骨骼肌的生長是一個(gè)嚴(yán)格而復(fù)雜的由分子調(diào)控的過程，與眾多信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、調(diào)節(jié)因子、基因有重要聯(lián)系[1]。線粒體是細(xì)胞的能量提供者，與肌肉能量代謝關(guān)系緊密，相關(guān)研究顯示，運(yùn)動(dòng)可以通過提高線粒體能量代謝，促進(jìn)衛(wèi)星細(xì)胞成肌分化[2-3]。不同品種的豬線粒體DNA間有著大量差異堿基，存在線粒體基因效應(yīng)，影響豬肌肉組織的能量代謝[4]。本研究選取體型差異較大的3種豬，其中大白豬是引進(jìn)自西方的大體型豬，生長快，瘦肉率較高，肉質(zhì)較差；姜曲海豬是我國原生的地方豬種，體型較大, 肌纖維較細(xì)，瘦肉率低，肌肉脂肪含量高，肉質(zhì)口感好；巴馬豬是我國原產(chǎn)的小型豬，痩肉率高，肉質(zhì)優(yōu)良[5-7]。已有研究表明豬肌肉生長發(fā)育及線粒體功能和細(xì)胞色素C氧化酶調(diào)節(jié)亞基4蛋白(cytochrome coxidase 4,COX4)、解偶聯(lián)蛋白2(uncoupling proteins,UCP2)、動(dòng)力相關(guān)蛋白1(dynamin related protein 1,DRP1)、視神經(jīng)萎縮癥蛋白1(optical atrophy-1,OPA1)、帕金森蛋白(Parkin)、B淋巴細(xì)胞瘤2蛋白(B-cell lymphoma-2,Bcl-2)和Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein,BAX)等有密切關(guān)聯(lián)。本研究通過比較上述蛋白在3個(gè)不同類型豬肌肉組織中表達(dá)的差異，結(jié)合相應(yīng)蛋白的主要功能分析，在基因水平探究豬體型發(fā)育、肉質(zhì)差異的機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)動(dòng)物

巴馬豬來自中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所試驗(yàn)豬場；姜曲海豬來自江蘇姜曲海種豬場；大白豬來自揚(yáng)州興泰農(nóng)牧科技發(fā)展有限公司。

1.2 主要試劑

DRP1(H-16)抗體、UCP2(N-19)抗體、Bcl-2(C21)抗體、COX4(G20)抗體、BAX(△21)抗體、GAPDH(I-19)抗體均購自Santa Cruz公司；Parkin(ab233434)抗體購自Abcam公司；OPA1(nb110-55290)抗體購自NOVUS公司。

1.3 方法

1.3.1 肌肉組織總蛋白的提取

分別選取3頭40日齡巴馬母豬(體重分別為3.2、3.4、3.1 kg)、40日齡姜曲海母豬(體重分別為8.5、7.0、7.0 kg)、40日齡大白豬母豬(體重分別為5.1、5.8、6.8 kg)，采集3～4肋間肌肉組織，提取組織總蛋白，提取方法參考文獻(xiàn)[8-9]。

1.3.2 Western blot 測定蛋白的相對表達(dá)量

提取的每份蛋白測定濃度后，每個(gè)品種3頭豬的蛋白等質(zhì)量進(jìn)行混合，每個(gè)混合蛋白4個(gè)重復(fù)，每孔上樣15 μg樣品，每種豬做4個(gè)重復(fù)，SDS-PAGE檢測 90 V轉(zhuǎn)膜后，2% BSA振蕩封閉30 min，孵育一抗和二抗，其中Western blot步驟詳見文獻(xiàn)[10]。用Analysis軟件測定雜交條帶灰度值，目標(biāo)蛋白灰度值和相應(yīng)內(nèi)參GAPDH條帶灰度值的比值為各目的條帶的相對表達(dá)量，各個(gè)檢測蛋白都以巴馬豬中相對表達(dá)量作為基準(zhǔn)值1.00。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

采用 SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，LSD 法檢驗(yàn)組間差異，P<0.05 為差異顯著，P<0.01為差異極顯著。數(shù)據(jù)用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示。

2 結(jié)果與分析

2.1 巴馬豬、姜曲海豬和大白豬肌肉組織中線粒體功能相關(guān)蛋白的檢測

應(yīng)用Western blot檢測巴馬豬、姜曲海豬和大白豬肌肉組織中與線粒體功能相關(guān)蛋白的結(jié)果見圖1，各蛋白相對表達(dá)量分析見圖2。結(jié)果表明COX4、OPA1、UCP2、DRP1蛋白在大白豬中的相對表達(dá)量最高，極顯著高于姜曲海豬和巴馬豬(P<0.01)，在巴馬豬中的相對表達(dá)量極顯著高于姜曲海豬(P<0.01)。

圖1 Western blot 檢測與線粒體功能相關(guān)蛋白的表達(dá)

相同蛋白不同品種間，*表示差異顯著(P<0.05)，**表示差異極顯著(P<0.01)。下同

2.2 巴馬豬、姜曲海豬和大白豬肌肉組織中能量代謝相關(guān)蛋白的檢測

3種豬肌肉組織中與能量代謝相關(guān)蛋白的相對表達(dá)量分析見圖3、圖4。BAX蛋白在巴馬豬和大白豬肌肉組織中極顯著高于姜曲海豬(P<0.01)。Bcl-2蛋白在大白豬中的相對表達(dá)量最高，極顯著高于姜曲海豬和巴馬豬(P<0.01)，在姜曲海豬中的相對表達(dá)量極顯著高于巴馬豬(P<0.01)。Bcl-2/BAX的相對表達(dá)量間的比值在姜曲海豬肌肉組織中極顯著高于巴馬豬和大白豬(P<0.01)，在大白豬中顯著高于姜曲海豬(P<0.05)。Parkin蛋白在大白豬中表達(dá)量極顯著高于巴馬豬和姜曲海豬(P<0.01)，在巴馬豬中極顯著高于姜曲海豬(P<0.01)。

圖3 Western blot檢測與能量代謝相關(guān)蛋白的表達(dá)

圖4 能量代謝相關(guān)蛋白在3種豬骨骼肌組織中相對表達(dá)量分析

3 討論

家豬是我國最重要的肉用養(yǎng)殖動(dòng)物，提高豬胴體凈肉率、優(yōu)化豬肉品質(zhì)是近年來養(yǎng)豬業(yè)的重要發(fā)展方向。已有研究結(jié)果表明，肌肉組織中存在多個(gè)調(diào)控能量代謝及線粒體功能相關(guān)的基因，是機(jī)體的能量工廠，線粒體基因表達(dá)的差異會對肌肉組織細(xì)胞的生長和凋亡產(chǎn)生影響，繼而影響肌肉組織的發(fā)育[11]。此前有研究通過對巴馬豬和大白豬不同組織中的斯鈣素-1(STC-1)及部分線粒體相關(guān)蛋白的分布進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在2個(gè)品種豬中部分基因存在顯著差異，推測豬線粒體功能可能與生長發(fā)育差異有關(guān)[10]。本研究在分析已有的研究基礎(chǔ)上，選取部分影響線粒體功能及肌肉組織代謝相關(guān)蛋白，首次在3種不同類型豬肌肉組織中進(jìn)行比較檢測。

本研究首先檢測了肌肉組織中線粒體功能相關(guān)蛋白COX4、OPA1、DRP1、UCP2表達(dá)量的差異。其中COX4是在ATP合成過程中起到關(guān)鍵作用的線粒體內(nèi)膜蛋白，COX4表達(dá)的提高和線粒體功能的增強(qiáng)相關(guān)[12-14]；DRP1存在于胞漿和線粒體外膜，是與線粒體分裂有關(guān)的蛋白，能使其分裂成許多小線粒體，DRP1表達(dá)水平高意味著線粒體功能活性強(qiáng)[15]；OPA1是位于線粒體內(nèi)膜上線粒體塑形蛋白，介導(dǎo)線粒體內(nèi)膜的融合，進(jìn)而促進(jìn)線粒體生物學(xué)活性[16]；UCP2是線粒體外膜上的蛋白，可以抑制活性氧的生成，減少線粒體受到的損傷，對細(xì)胞起到保護(hù)作用，此外UCP2有通過降低氧化應(yīng)激來調(diào)節(jié)脂質(zhì)在體內(nèi)代謝的功能[17-18]。上述蛋白具有保護(hù)或促進(jìn)線粒體功能，表達(dá)升高說明線粒體功能強(qiáng)。本研究中大白豬肌肉組織中上述蛋白表達(dá)量最高，可能與其是瘦肉型豬有關(guān)。肌纖維中線粒體功能和數(shù)量顯著高于脂肪組織，而上述蛋白均促進(jìn)線粒體功能，因此在動(dòng)物機(jī)體中促進(jìn)肌肉生成、減少脂肪生成。

本研究還檢測了3種不同品種豬肌肉組織中能量代謝相關(guān)蛋白Bcl-2、Parkin、BAX的差異。Bcl-2蛋白有明確的抗細(xì)胞凋亡作用，它的高表達(dá)可能通過促進(jìn)細(xì)胞增殖而增快豬的新陳代謝和生長速度。BAX是Bcl家族的一員，是重要的促凋亡因子，Bcl-2可以與BAX結(jié)合形成異二聚體Bcl-2/BAX，在抑制細(xì)胞的凋亡上更具有生物學(xué)意義。通常Bcl-2/BAX的比值越大，其抗凋亡能力越強(qiáng)，能量代謝效率也較高[19-20]。本研究中發(fā)現(xiàn)Bcl-2/BAX的比值在姜曲海豬和大白豬肌肉組織中相對表達(dá)量較高，顯著高于巴馬豬，這說明Bcl-2/BAX可能通過提高能量利用進(jìn)而促進(jìn)生長速度。Parkin是與線粒體自噬相關(guān)的蛋白，通過同種途徑抑制線粒體受損，促進(jìn)脂肪酸代謝，減少脂肪生成[21-22]。本研究發(fā)現(xiàn)Parkin蛋白在瘦肉型豬巴馬豬和大白豬中均極顯著高于脂肪型姜曲海豬，說明該蛋白可能和豬的肉質(zhì)類型相關(guān)。

綜上，在3種不同體型豬中，與線粒體功能和能量代謝相關(guān)蛋白在不同品種豬肌肉組織中表達(dá)的差異較好地解釋了豬種肉質(zhì)類型和體型的差異，本文為進(jìn)一步研究不同品種家豬體型及肉質(zhì)的差異機(jī)制提供了參考。