肝泡型包蟲病侵及膽道患者膽汁外泌體microRNA的檢測及生物信息學分析

王志鑫，茍 平，于文昊, 任 利，陽丹才讓，王海久，樊海寧

1 青海大學附屬醫院 肝膽胰外科 西寧 810000； 2 青海省包蟲病重點實驗室，西寧 810000；3 成都京東方醫院 普通外科，成都 610000

泡型包蟲病為多房棘球蚴感染致病，它以浸潤方式增殖，類似腫瘤，可不斷產生新囊泡，直接侵犯鄰近的組織結構(如肝臟Glisson鞘)。臨床上常可觀察到肝泡型包蟲病(hepatic alveolar echinococcosis，HAE)患者出現黃疸進行性加重、反復感染以及各肝門部重要管道結構受侵等表現。這類患者預后較差，肝移植成為了最后選擇[1]。膽汁作為一種非循環體液，蘊含豐富的膽道疾病信息，且局部囊泡的濃度高，幾乎不受遠隔器官病變的影響[2-3]。本研究以HAE侵及膽道患者膽汁中外泌體為對象，進行microRNA(miRNA)表達譜芯片實驗及生物信息學分析，探索HAE侵及膽道的相關機制，為改善此類患者預后提供參考。

1 資料與方法

1.1 研究對象 收集自2017年8月-2018年10月就診于青海大學附屬醫院，經包蟲IgG抗體試驗、腹部CT/MRI檢查診斷為HAE的12例患者膽汁樣本。觀察組(A組，n=6)：有膽道受侵表現[4-5][有阻塞性黃疸；CT/磁共振胰膽管造影(MRCP)提示肝內包蟲占位病灶鄰近主要膽道分支且二者關系密切，相應區段肝內膽管明顯擴張]，為經皮經肝膽管引流術(percutaneous transhepatic cholangial drainage，PTCD)穿刺后第1天收集；對照組(B組，n=6)：無膽道受侵表現(無阻塞性黃疸；CT/MRCP提示肝內包蟲占位病灶鄰近區段膽管無擴張)，為全麻手術入腹后穿刺膽囊收集。

1.2 研究方法

1.2.1 膽汁樣本收集與保存 經全麻術中或PTCD穿刺后第1天收集膽汁樣本。收集后經4000×g離心15 min后，吸取上層澄清部分置于-80 ℃冰箱凍存。過程中嚴格無菌操作，凍存后避免樣本反復凍融，且保證只在提取外泌體時才被解凍。

1.2.2 膽汁樣本中外泌體RNA提取及質檢 將上述膽汁樣本送至上海吉凱基因化學技術有限公司，使用超速離心機(美國Thermo公司)提取并經Western Blot鑒定膽汁樣本中外泌體結構后，用Trizol試劑(美國Thermo公司)提取各樣本外泌體總RNA，經Nanodrop 2000(超微量紫外分光光度計，美國Thermo公司)測定各樣本總RNA濃度，對滿足芯片實驗上樣需要(130～1000 ng)的樣本進行miRNA表達譜芯片實驗。

1.2.3 miRNA表達譜芯片實驗 使用RNA Labeing Kit及GeneChip miRNA 4.0(美國Affymetrix公司)分析獲得miRNA表達譜。以|Fold Change|>2作為顯著性差異標準，篩選差異miRNA。

1.2.4 差異miRNA的生物學信息分析 兩組比較，若差異miRNA表達上調，定義差異表達倍數Fold Change=觀察組/對照組；若表達下調，則定義Fold Change=-對照組/觀察組。以|Fold Change|>2作為顯著性差異的篩選標準。選擇差異倍數最大的10個miRNAs，在Targetscan、miRNA.ORG和miRDB三個數據庫中進行靶基因預測，選取Count數(即該基因在數據庫中被預測到的頻次)為3的基因作為該miRNA的靶基因，以提高可信度。以錯誤發現率(false discovery rate，FDR，即P值經Fisher精確檢驗后，再經Benjamini-Hochberg校正所得)<0.05為顯著性指標，進行Pathway分析及GO注釋富集分析。

1.3 倫理學審查 本研究方案經由青海大學附屬醫院倫理委員會審批(批號：P-SL-2019072)。

2 結果

2.1 外泌體標志性蛋白檢測 提取膽汁中外泌體后，經Western Blot檢測外泌體標志性蛋白(CD63、CD9、TSG101)。結果顯示，兩組樣本中均檢測到不同表達程度的標志性蛋白，證實各膽汁樣本中外泌體客觀存在(圖1)。

2.2 芯片數據的質量評估

2.2.1 信號強度分布統計 圖2顯示各樣本芯片探針的信號強度重合度好，芯片實驗可靠性高。

2.2.2 相對對數信號強度統計 圖3顯示各樣本相對對數信號強度箱線圖的分布相近，數據的重復性好，芯片數據質量較好。

2.3 miRNA的顯著性差異分析 經miRNA表達譜芯片實驗后，以|Fold Change|>2作為顯著性差異標準，篩選表達差異miRNA。結果顯示，A組與B組比較，共有74個顯著差異表達的miRNAs，其中9個表達上調，65個表達下調(表1)。

2.4 顯著性差異miRNA的生物信息分析

2.4.1 靶基因預測 選擇差異倍數最大的10個miRNAs，進行靶基因預測。選取Count數量為3的基因作為該miRNA的靶基因。結果共預測到45個靶基因，包括AFF3、STK4、PIK3R1、PTEN等(表2)。

2.4.2 相關信號通路分析 通過基于KEGG & BioCarta的通路注釋及富集分析發現，A組相較于B組，靶基因主要在腫瘤發生(pathways in cancer)、磷脂酰肌醇信號系統(phosphatidylinositol signaling system)、PTEN、AKT等通路中顯著富集表達，預示HAE侵及膽道后，顯著影響了這些通路的信號轉導過程(圖4)。

2.4.3 GO注釋 經GO注釋發現，A組相較于B組，靶基因主要在GO-BP方面富集表達，預示著HAE侵及膽道后，顯著影響了包括基因抑制的正向調控(positive regulation of gene repression)、調控細胞分化(regulation of cell differentiation)等在內的生物過程(圖5)。

表1 74個顯著差異miRNAs及表達情況

表2 靶基因預測結果

3 討論

外泌體是具代表性的一類囊泡結構，它是由多種細胞在生理或病理狀態下分泌的一種微小囊泡，含大量與其來源和功能密切相關的蛋白質、脂質、核酸等物質[6]。miRNA是一類由內源基因編碼的非編碼單鏈RNA分子，是轉錄后機制的重要調節因素，它主要通過參與基因的轉錄后調控實現對靶基因的表達調控，從而影響各種生命活動進程[7]。在宿主-寄生蟲相互作用過程中，外泌體miRNA起著重要的調節作用。宿主被蠕蟲感染后，相關宿主細胞或組織中miRNA失去了調節功能，預示miRNA這種功能變化導致了寄生蟲感染、致病宿主的病理過程[8]。寄生性絳蟲分泌的細胞外囊泡包含有miRNA及免疫診斷性蛋白等物質成分[9]。miRNA不同于基因或蛋白，它具有時空性或階段性特點，即在同一疾病不同狀態下其表達量存在差異。本研究以差異倍數|Fold Change|>2作為篩選差異miRNA的主要指標。經miRNA表達譜芯片分析得出差異顯著的10個miRNAs分子，可作為診斷HAE侵及膽道的生物學標志物。因此可以預測，當包蟲病灶侵犯膽道后，人體分泌、釋放的外泌體及外泌體中的包裹物(如miRNA)也隨之受到影響。通過分析HAE侵犯膽道后膽汁中外泌體miRNA的表達特征，篩選出差異顯著的miRNA作為膽道受侵生物標記物，可為后期臨床應用微流控等床旁檢測儀分析膽道穿刺液或引流液中外泌體特異性miRNA奠定實驗基礎。在分析膽汁外泌體差異miRNA的基礎上，可結合膽道造影、CT、MRCP等進行術前規劃、風險評估。若上述依據支持包蟲病灶累及主要膽道，則需考慮術中對侵犯部位膽道進行完整切除及重建可能，或者在面臨包蟲病灶不可切除的情形下(如合并重要血管的侵犯)，為選擇姑息手術抑或等待肝移植等治療方案時提供臨床抉擇，因此具有臨床指導意義。

Masyuk等[10]研究表明，膽汁中外泌體與膽管細胞纖毛相互作用時，會影響ERK1/2(細胞外信號調節激酶)信號通路而使miRNA-15a表達增加，進而導致膽管細胞增殖減少。這反應出膽汁中外泌體miRNA通過調控信號通路活動水平而影響某些生理或病理過程。本研究對上述差異顯著的10個miRNAs分子進行靶基因預測，共預測到45個靶基因。經基于KEGG & BioCarta的通路富集分析[11]顯示，上述靶基因在腫瘤發生、磷脂酰肌醇信號系統、黑色素瘤、PTEN等通路中富集程度較高，預示HAE侵及膽道后顯著影響了上述通路的信號轉導或代謝過程。經GO注釋[12]及富集分析顯示，靶基因主要在GO-BP方面富集表達，預示HAE侵及膽道后顯著影響了包括基因抑制的正向調控、調控細胞分化、生殖系統發生發展等在內的生物過程。

本研究的不足在于實驗樣本量較少，未進行qPCR驗證差異miRNA及靶基因。實際情況歸因于膽汁樣本的取材較困難，只能經PTCD或在包蟲病灶聯合膽囊切除術中穿刺膽囊的途徑獲得，可在取材過程中無菌操作。尚有部分晚期HAE患者放棄臨床治療，不能經上述途徑收集膽汁樣本，造成了部分符合入組標準的病例流失。后期需繼續收集符合篩選標準的膽汁樣本，并經qPCR擴增、驗證差異的miRNA。