虎斑烏賊神經肽sCAP 基因克隆與表達分析

（浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養殖工程技術研究中心，海洋生物種質發掘與利用國家地方聯合實驗室，浙江舟山 316022）

目前關于頭足類神經肽的研究主要集中在如GnRH、FaRPs 和APGWamide 等分子多肽方面[1-3]，而在生理調節過程中意義重大的sCAP 研究較少。sCAP 在刺激心臟運動[4]、控制肌肉收縮[5]、輸卵管收縮、增強后腸收縮[6]及生物蛻皮等生理過程中有重要作用[7]。sCAP 最初發現于長蛸Octopus minor 的腦組織中，有Ocp-1、Ocp-2、Ocp-3 和Ocp-4 四種類型[8]。其相關類似物oct-SCPRP 也被發現于真蛸Octopus vulgaris中，具有收縮牙齒及舌頭牽拉肌的作用[9]。有研究表明Ocp-1 和Ocp-2 是非洲大蝸牛Achatina fulica 中Achatin-Ⅰ的同源基因產物，Ocp-1 可通過影響紅螺Rapana thomasiana 中谷氨酸含量刺激心臟收縮[10-11]。綜上，開展對sCAP 參與的各種生理功的鑒定研究具有非常重要意義。

虎斑烏賊Sepia pharaonis，屬軟體動物門Mollusca、頭足綱Cephalopoda、十腕目Sepiida、烏賊科Sepiidae、烏賊屬Sepia，廣泛分布于35 °S-30 °N、30 °E-140 °W 的海域。虎斑烏賊為經濟頭足類，其個體較大，口味鮮美，蛋白質含量高，且適合高密度養殖、有較強的抗病力及快速生長等優點，是經濟價值較高的名優新品種。但是自20 世紀80 年代以來，由于海域生態環境惡化和過度捕撈，虎斑烏賊自然資源遭到極大破壞，并開始出現衰退現象[12]。目前，虎斑烏賊的人工養殖和增殖放流工作已經在我國的一些地區展開，并且取得了實際經濟效益。

本研究采用RACE 技術克隆獲得虎斑烏賊sCAP 基因(以下簡稱SpsCAP)的cDNA 全長序列并開展生物信息學分析；采用qRT-PCR 技術研究sCAP 基因在虎斑烏賊成熟的雌性個體和雄性個體不同組織中表達的差異性，進而推測sCAP 基因在烏賊中的可能生理功能，并為虎斑烏賊的種質資源保護和開發奠定一定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗樣品

性成熟時期的虎斑烏賊(體重1 500～2 000 g)從浙江省溫州市蒼南養殖基地采樣，虎斑烏賊被麻醉后解剖，取出組織放在凍存管內，將凍存管立即放入液氮中，在液氮中存放24 h 后，用干冰快遞運回實驗室，-80 °C 保存備用。

1.2 總RNA 的提取及cDNA 第一條鏈的合成

虎斑烏賊各組織總RNA 使用RNAiso Plus(Takara 公司)進行提取。2 μg 總RNA 用于cDNA 第一條鏈的合成，實驗方法參照M-MLV (Rnase H-)反轉錄試劑盒(Takara 公司)說明書方法進行。

1.3 虎斑烏賊sCAP 基因核心片段的擴增

根據NCBI 已有的商烏賊(Sepia officinalis，AFS32691.1)、真蛸(AB198190.1)、靜水椎實螺(Lymnaea stagnalis，AF056941.1)和長牡蠣(Crassostrea gigas，EU152957.1)的sCAP 基因序列，設計虎斑烏賊sCAP 基因核心片段的簡并引物Sp-sCAP-F 和Sp-sCAP-R，見表1。

以性成熟時期的虎斑烏賊腦組織cDNA 為模板，采用25 μL PCR 體系根據Premix Taq 試劑(Takara公司)說明書進行，PCR 產物經過用1.2%的瓊脂糖電泳檢測后送至上海生工進行測序。

表1 SpsCAP 基因所用引物Tab.1 Primers used in SpsCAP clone

1.4 虎斑烏賊sCAP 基因cDNA 全長的克隆

根據SpsCAP 基因核心序列設計5’RACE 和3’RACE 的引物 (表1)。cDNA 全長的擴增根據SMARTTMRACE 試劑盒(Takara 公司)說明書進行。PCR 產物經純化、連接、轉化最后將菌液送至上海生工生物公司測序。

1.5 虎斑烏賊sCAP 基因cDNA 全長序列分析方法

采用DNAMAN 軟件對SpsCAP 基因的5’端、3’端和核心序列的測序結果進行拼接，獲得SpsCAP 基因的全長序列；在NCBI 上預測蛋白的ORF 并將全長序列與ORF 的驗證序列進行比對；利用在線軟件Expasy-ProtParam(http：//we-b.expasy.org/protparam/)[13]將其翻譯為氨基酸序列并預測蛋白的相對分子質量和等電點；采用TMHMM Server v.2.0 (http：//www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預測蛋白的跨膜結構域；利用SignalIP[14](http：//www.cbs.dtu.dk/service/SignalP/) 預測蛋白質序列中的信號肽區域；利用在線軟件Net-NGly 1.0 Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/) 預測蛋白的糖基化位點；利用在線軟件NetPhos 3.1 Server (http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/) 預測蛋白的磷酸化位點；利用ExPASy-ProtScale[15](http：//web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)預測蛋白的親疏水性；利用在線軟件Prabi(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/secpred_gor4.pl)預測蛋白的二級結構；利用ClustalX[16]以及MEGA6.0[17]軟件將其與已知物種的心激肽基因進行同源性比對；用MrBayes v3.2.6 軟件[18]采用貝葉斯推理方法(Bayesian inference，BI)構建系統進化樹，建立4 個馬爾可夫鏈，共運行2 000 000 代，每100 代進行一次抽樣，舍棄樣本25%后根據殘余樣本計算后驗概率(Posterior probability)，利用在線軟件ITOL(http：//itol.embl.de/itol.cgi)對進化樹進行注釋[19]。

1.6 虎斑烏賊sCAP 基因組織定量表達特異性分析

選取性成熟時期的虎斑烏賊取出不同組織包括胃、肝臟、皮膚、腸、胰、鰓、肌肉、心臟、腦、視葉、性腺(精巢和卵巢)、纏卵腺和副纏卵腺，根據已經得到的虎斑烏賊sCAP 基因的cDNA 全長，利用Primer 6.0 設計qRT-PCR 所用到的引物，選擇β-肌動蛋白作為內參基因。虎斑烏賊sCAP 基因qRT-PCR 所需的引物見表1。使用相對定量方法分別檢測雌、雄個體虎斑烏賊sCAP 基因不同組織的表達特異性，雌雄各選擇3只做3 次生物學重復，每個個體的每個組織的定量表達做3 次機械重復。qRT-PCR 實驗操作參考SYBR Premix Ex TaqTM II Kit(Takara 公司)試劑說明書進行。

2 結果

2.1 虎斑烏賊sCAP 基因cDNA 全長分析

虎斑烏賊sCAP 的序列全長為666 bp，包含可編碼86 個氨基酸的261 bp 的ORF、109 bp 的5'-UTR、296 bp 的3'-UTR。預測分析表明該基因所表達的蛋白MW 為9.3 kDa，pI 為8.52。

虎斑烏賊sCAP 的前體蛋白預測含有20 個氨基酸的信號肽段，跨膜結構域為7-29th位點(圖1、圖2)。前體蛋白序列包含蛋白修飾位點為：2 個N-糖基化位點(5，21)；10 個磷酸化位點包含6 個Ser 位點(3-7-23-35-72-79)、3 個Thr 位點(18-22-76) 和1 個Tyr 位點(24)(圖1)。預測二級結構發現該前體蛋白含33.72 %的延伸鏈和66.28 %的無規則卷曲。通過親疏水性分析，發現該蛋白含有28 個疏水性氨基酸和58個親水性氨基酸，因此推測其為親水性蛋白(圖3)。

圖1 虎斑烏賊sCAP 基因cDNA 全長Fig.1 Full-length cDNA sequence and predicted amino acid sequence of sCAP in S.pharaonis

圖2 SpsCAP 蛋白跨膜結構域預測結果Fig.2 Transmembrane domain result for SpsCAP

圖3 SpsCAP 親疏水性分析Fig.3 Hydrophobic analysis of SpsCAP

2.2 虎斑烏賊sCAP 氨基酸序列分析

虎斑烏賊的sCAP 氨基酸序列通過MEGA6.0 和DNAMAN 軟件與其它6 個物種進行比對(圖4)。結果顯示，虎斑烏賊sCAP的氨基酸序列與曼氏無針烏賊(Sepiella japonica，MG779491)、商烏賊(AFS32691.1)、雙斑蛸(Octopus bimaculoides，XP014771607.1)、真蛸(Q2V2G5.1)的相似性分別為98%、88%、66%、54%，與曼氏無針烏賊的相似度最高；與野蛞蝓(Deroceras reticulatum，ARS01388.1)的相似性為35%，與Pleurobranchaea californica(ABU82753.1)的相似性僅為33%。

圖4 SpsCAP 氨基酸序列比對Fig.4 Multiple alignment of the deduced amino acid sequences of sCAP precursor from S.pharaonis and other species

2.3 虎斑烏賊sCAP 基因的系統進化樹構建

在NCBI 上選取了57 條不同物種的與sCAP 功能類似的心激肽基因的序列，通過MEGA 6.0 軟件將這些序列與SpsCAP 基因的氨基酸序列進行比對，再通過MrBayes v3.2.6 軟件基于BI 的方法構建系統進化樹(圖5)。結果顯示，虎斑烏賊sCAP 基因與曼氏無針烏賊的親緣關系最近，其次是商烏賊，并且與雙斑蛸、真蛸等軟體動物聚為一支，與節肢動物相應的分子聚類成另外的分支(圖5)。

圖5 SpsCAP 同源氨基酸序列構建的貝葉斯系統進化樹Fig.5 Evolutionary trees based on SpsCAP homologous amino acid sequences with Bayesian methods

2.4 虎斑烏賊sCAP 基因組織定量表達特異性分析

SpsCAP 在虎斑烏賊的腦、視葉、胃、肝、皮膚、腸、胰臟、性腺、肌肉、心、纏卵腺、副纏卵腺各個組織中均有表達(圖6)。其中SpsCAP 在視葉組織中表達量最高，其次是腦組織，并且與其它組織進行多重比較有顯著性差異；雄性烏賊的視葉組織與雌性烏賊的視葉組織表達量也存在顯著性差異，且雄性烏賊的視葉相對表達量是雌性烏賊的相對表達量的4 倍，造成這種差異可能原因是SpsCAP 在雌雄個體上發揮的作用存在差異。

圖6 SpsCAP 基因不同組織表達特異性Fig.6 Distribution of SpsCAP mRNA in various tissues

3 討論

目前有關于心激肽的研究集中在甲殼類、昆蟲類以及腹足類中。CAPs 和CAP2 是存在于昆蟲的中樞神經系統，也同樣具有刺激心臟運動的功能[20]，CAP2 還參與胚胎發育中腸道運動的調節[21]；SCP 和SCPB 被稱為小心激肽，它們不僅可以刺激心臟運動[22]，還可以控制肌肉的收縮[23]；LCP 被稱為大心激肽，研究表明它可能具有刺激心臟運動的作用[24]；CCAP 最初是從普通濱蟹Carcinus maenas 的圍心器官中被發現的[25]，它不僅可以刺激心臟運動，還參與生物的蛻皮[26]、刺激輸卵管收縮[27]、增強后腸的收縮[28]、控制肌肉的收縮、調節包括視覺和嗅覺在內的各種神經系統的功能[29]，還具有作為脂肪動力激素釋放因子的作用[30]和調節口腔胃神經節等功能[31]。因此可以推測SpsCAP 也可能具有以上提出的功能。

本研究應用qRT-PCR 技術和RACE 技術，首次從虎斑烏賊腦組織中克隆到sCAP 基因，并研究其在雌雄虎斑烏賊各個組織中的差異表達。SpsCAP 全序列與其他頭足類的相應序列同源性均較高，與曼氏無針烏賊的相應序列同源性最高。進化分析顯示虎斑烏賊sCAP 與曼氏無針烏賊、真蛸等軟體動物相應的同源分子聚為一支，而與節肢動物相應的分子聚類成另外的分支。

通過qRT-PCR 表達分析，SpsCAP 的表達在雄性及雌性虎斑烏賊的視葉中被明顯檢測到，其次是腦，表明sCAP 可能通過虎斑烏賊的神經系統來控制其活動。SpsCAP 在纏卵腺及副纏卵腺中微量表達說明其可能與輸卵管的收縮功能有關[32]。從表達量分析，雄性個體的表達量明顯高于雌性個體，表達量最顯著的視葉組織雄性的表達量與雌性之間也有顯著性差異，并且雄性烏賊與雌性烏賊在視葉組織的相對表達量相差4 倍，可能是因為不同性別的組織差異性導致的，推測該基因在控制雌雄個體生理活動時可能存在性別差異，還需進一步實驗驗證。有研究學者用RT-PCR 的方法對昆蟲中的甲殼類心激肽CCAP 進行了研究，結果顯示其在不同發育階段均有表達，表達最多的是在幼蟲到蛹過渡的階段[33]，表達水平波動在幾個發育階段的過程中，直到發育后期一些細胞依然沒有表達[33-34]，細胞內刺激識別的神經元可以引起心臟運動加速[35]。因此，sCAP 在不同發育時期的虎斑烏賊體內的表達量也應作為后續的一個研究方向，鑒定在不同發育時期時sCAP 在虎斑烏賊視葉等組織中的表達變化，可以進一步的研究該基因的相關功能，以及為后續的組織定位，免疫組織化學實驗奠定依據。