生殖細胞及胚胎凍存技術發展及展望

(浙江海洋大學海洋科學與技術學院，國家海洋設施養殖工程與技術研究中心，浙江舟山 316022)

生殖是生命活動的基本過程，人類對自身及其他生物的生殖研究歷史久遠。隨著現代生物學研究技術的快速發展，人工授精等一系列生殖操作技術得到了大規模運用，為于人類生殖醫療及養殖產業的發展提供了新的動力。作為人工授精技術的重要組成，多種生殖細胞及胚胎的凍存方法已被開發并獲得了成功應用。1953 年，BLAXTER[1]成功實現了太平洋鯡魚Clupea harengus 的精巢冷凍保存，之后，生殖細胞的低溫保存技術得以迅速發展。本文對動物生殖細胞及胚胎凍存技術進行了梳理和總結，以期為相關研究及技術開發提供參考。

目前，有關生殖細胞冷凍保存技術已經獲得廣泛應用，包括哺乳動物、魚類以及一些無脊椎動物(包括軟體動物[2]、棘皮動物[3]等)。根據冷凍保存的技術差異以及生殖細胞冷凍保存的方式，生殖細胞凍存方法主要分為慢速冷凍和快速冷凍。慢速冷凍也稱慢速程序化冷凍，是指將細胞置于冷凍保護劑中，利用程序冷凍儀或不同溫差的冰箱實現分階段降溫。該技術的原理首先是利用細胞外溶液中的水分結冰使溶液的濃度升高，細胞內的水分透過細胞膜向外滲出，細胞體積收縮，細胞內液的濃度與滲透壓增加，冰點下降；隨著溫度的下降，上述過程持續進行，到一定的溫度時結冰，并在此溫度下長期保存。當細胞內液在零下某一溫度結冰時，溶液先是凝結成小冰晶，細小的冰晶對細胞損害較少，但小冰晶表面勢能大，往往互相結合成大冰晶，造成細胞結構的破壞，該現象易發生在-15 ℃至-60 ℃范圍內[4]。由于細胞在冷凍和解凍過程中要經歷兩次冰晶生成帶來的損傷，常導致細胞壞死，是慢速冷凍技術難以避免的缺點。為降低冰晶損傷，通常可在慢速冷凍過程中使用低濃度的保護劑，同時通過精準的程序降溫來減少冰晶生成。但是保護劑通常帶有細胞毒性，緩慢程序降溫對設備要求較高，限制了該技術的推廣應用。

快速冷凍法是目前常用的生殖細胞凍存方法，如常用的玻璃化冷凍技術，是指將高濃度的冷凍保護劑在超低溫環境下迅速凝固，形成不規則的玻璃化樣固體，保存了細胞在液態時正常分子和離子分布，對細胞結構及胞內組分起到保護作用，實現低細胞損傷冷凍保存。目前，玻璃化凍存降溫速率被認為應大于1 500 ℃·min-1[5]。玻璃化冷凍技術操作簡單，能有效避免胞內冰晶的形成，從而降低細胞因形成冰晶而導致的各種物理及化學損傷。然而，快速冷凍過程中添加的高濃度冷凍保護劑本身具有較大的細胞毒性作用，會造成一定的細胞損傷。由于快速冷凍法操作相對簡便，冷凍形成的損傷相對較小，設備要求較為簡單，已經成功應用于不同動物的精子、卵子和胚胎保存[6-7]；而冷凍速率和冷凍保護劑濃度的優化成為快速冷凍法的研究熱點。

1 精子冷凍保存技術

脊椎動物的精子冷凍保存技術研究報道較為常見，冷凍方法也較為成熟。抗凍液的應用是精子凍存技術的關鍵，抗凍液可以提高精子冷凍保存的成活率，主要包括精子稀釋液和冷凍保護劑。精子稀釋液主要是由一些鹽(NaCl、KCl、NaHCO3)和蒸餾水組成[8]，所含的滲透性保護劑可以與水溶劑發生水合反應，增加溶液的粘性，從而在一定程度上抑制冰晶的產生，最終達到保護細胞和抗凍的效果。精子冷凍稀釋液要求不能激活精子，主要成分可以分為鹽類、糖類、脂類、蛋白質以及其他添加劑等成分，加蒸餾水按不同的比例配制而成[9]。

冷凍保護劑分為滲透性和非滲透性2 種，它們均可降低溶液冰點和電解質濃度，減少冰晶的形成。滲透性的冷凍保護劑一般是小分子物質，主要有二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)、甘油(glycerine，GLY)、甲醇(methanol，METH)、乙二醇(ethylene glycol，EG)、丙二醇(propylene glycol，PG)、二甲基甲酰胺(dimethylformamide，DMF)和二甲基乙酰胺(dimethylacetamide，DMA)等，其滲透(平衡)到胞內的時間因冷凍材料和冷凍保護劑種類而不同。滲透性保護劑經常被用來增強膜流動性并使細胞部分脫水，導致凝固點降低，減少細胞內冰晶形成數量和大小。然而，滲透性的冷凍保護劑本身對精子具有毒性作用，具體應用需要對特定保存對象進行技術優化。非滲透性冷凍保護劑也稱膜外保護劑，如果糖(Fructose)、蔗糖(Sucrose，SUC)、海藻糖(trehalose，TRE)蜂蜜和一些高分子化合物，如聚乙烯吡咯酮(polyvinylpyrrolidone，PVP)、右旋糖酐(Dextran)、卵黃(Yolk)、白蛋白(Albumin)等，這類物質不能穿過精子細胞膜，其作用是通過維持細胞膜的穩定來保護精子。非滲透性冷凍保護劑能夠提高細胞外滲透壓，在冷凍過程中使細胞內的水分快速向細胞外滲出，減少細胞內水分，從而減少細胞內冰晶形成，保護細胞免遭因冰晶形成而造成的機械損傷。另外，在冷凍精液復溫時，由于非滲透性保護劑在細胞外液形成的高滲濃度，可以有效防止水分快速進入細胞引起的腫脹破壞脊椎動物精子的冷凍保存。

1.1 脊椎動物精子冷凍保存技術

由于魚類精子個體小，抗凍劑容易進入其內，冷凍保存較易成功。魚類精子冷凍保存關鍵步驟在于冷凍保存前的平衡時間和溫度、降溫速率及復蘇條件等，由于這些問題比較雜，各學者之間的看法不盡相同，所采用的方法也不完全一致。以8.3%甲醇作為冷凍保護劑，將斑馬魚Danio rerio 精子用-16 ℃·min-1的速率從4 ℃降到-35 ℃，并采用室溫復蘇的方法，得到了36%的受精率[10]。改變降溫速率和復蘇條件，可以提高精子的存活率。用-10 ℃·min-1的速率從5 ℃降到-80 ℃，40 ℃水浴5 s 解凍，得到(33±20)%的存活率[11]。改進斑馬魚精子凍存降溫程序和保護劑類型，可以提高其受精率[12]。精子在冷凍過程中除了受到冷休克、冰晶體的形成和滲透壓的變化的影響外，精子的生存和運動依賴糖酵解和線粒體氧化磷酸化提供能量，精子代謝會導致精細胞內活性氧自由基(Reactive Oxygen Species，ROS)過量，破壞精子質膜和DNA 的完整性。在實踐中，通常在精子稀釋液中添加抗氧化劑，防止ROS 對精子產生毒害作用從而降低精子質量。常用的抗氧化劑包括超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)、過氧化氫酶(Catalase，CAT)、維生素C、維生素E、半胱氨酸(Cystine，Cys)、麥角硫因(Ergosterol，EGT)和其他抗氧化劑。維生素C 具有強還原性，可有效防止ROS 過量造成的對精子的危害。有研究表明在波爾山羊凍精稀釋液中添加維生素C，可提高解凍后精子質量和受精率[13-14]。另外，在絨山羊精子稀釋液中添加葡萄糖(Glucose,Glu)可以促進冷凍解凍過程中的代謝，提高絨山羊精子冷凍保存效果[15]。通過最小化冷卻體積可以實現降低滲透性冷凍保護劑濃度的目標，由于大多數無冷凍保護劑玻璃化中的精子懸浮液體積相對較大，這種技術難以實現。通過評估運動性，細胞質膜完整性和線粒體膜完整性分析玻璃化前后精子的質量，MERINO,et al[16]認為含有1% BSA 加40%精漿的魚精子的無冷凍保護劑玻璃化是最有希望的。

1.2 無脊椎動物精子冷凍保存技術

慢速冷凍法也廣泛應用于其他海洋無脊椎動物精子凍存中。使用二甲基亞砜作為冷凍保護劑，-6 ℃·min的速率降到-80 ℃，再以10～15 ℃·min-1的速率復蘇到室溫，可以得到13%～33%的海膽Pseudocentrotus depressus 受精率[17]；使用同樣的方法保存紫海膽Anthocidaris crassispina 精子，得到10%有活力的精子[18]。改變降溫速率和復蘇方式可以提高受精率，同樣使用二甲基亞砜作為冷凍保護劑，保持在液氮上方6 cm處，37 ℃水浴復蘇后得到76%有活力的仿刺參Apostichopus japonius 精子[19]，5%二甲基亞砜+1 mol·L-1海藻糖；在液氮中保持15 min；25 ℃，30 s 水浴復蘇，得到89%有活力的珠母貝精子[20]。選擇合適的冷凍保護劑可以提高凍存效率，添加0.5 mol·L-1的海藻糖，濃度為12%的二甲基亞砜作為冷凍保護劑，綠唇貽貝Perna canaliculus 精子解凍后具有高達60%的受精率，而采用6%二甲基亞砜加1%甘氨酸作為保護劑，可以將受精率進一步提高到84%[21]。目前研究報道的部分冷凍保存方案和活力評估數據見表1。

2 卵母細胞冷凍保存技術

卵母細胞冷凍保存技術與精子凍存方法差異較大。哺乳動物卵母細胞的體積比精子的體積大3～4 個數量級，因此大大降低了比表面積，使其對冷卻和細胞內冰晶的形成非常敏感。當卵母細胞暴露于高濃度的冷凍保護劑時會因為細胞毒性和滲透而遭受破壞，這種毒性作用的大小與細胞暴露于冷凍保護劑的持續時間、細胞在冷凍保護劑中的平衡溫度、溫度下降速度以及卵母細胞本身的大小等因素密切相關。因此，成功實現卵母細胞玻璃化和冷凍保存，其關鍵在于確定使用合適濃度的冷凍保護劑，在毒性和冷凍損傷防御之間取得平衡而達到最大的冷凍保護效果。

表1 精子冷凍保存方案及活力評估舉例Tab.1 Examples in sperm cryopreservation

卵母細胞玻璃化過程和升溫過程中，主要受損部位在于其細胞骨架。卵母細胞的細胞骨架主要由微管、微絲和中間纖維等構成，在卵母細胞的成熟、受精及早期胚胎發育中發揮了重要作用[22-23]。研究表明，長時間暴露在冷凍保護劑和低溫中可能會導致微管的破壞，引起卵母細胞減數分裂時紡錘體形態的變化[24]。對于脊椎動物卵母細胞中，玻璃化的方法已經被用于多種物種[25-27]。凍存時間對卵母細胞復蘇后的存活率有很大影響，凍存時間越長，存活率、受精率和胚胎發育率越低[28]。目前在卵母細胞玻璃化冷凍的相關研究中，常采用梯度平衡法進行預平衡。首先在不同濃度的保護劑中進行梯度平衡，之后再直接將卵母細胞投入液氮中進行保存。梯度平衡法所用的冷凍保護劑通常是只含有單種或少數幾種冷凍保護劑聯合的滲透性保護劑，且濃度較低，因此對卵細胞的毒性和損傷較小。

2.1 脊椎動物卵母細胞凍存技術

脊椎動物卵母細胞的凍存通常采用兩步法進行，即首先通過緩慢降溫至一定低溫，然后快速降溫至-196 °C。該方法具有較好的應用，如在牛卵母細胞凍存中，使用兩步冷凍法保存的卵子受精后的懷孕率在50%～60%之間[29]。而比較慢速冷凍法和玻璃化法凍存小鼠卵母細胞，發現兩種冷凍方法均會損傷卵巢內各級卵母細胞，慢速冷凍法對卵巢組織的傷害更小一些[30]。

天然氨基酸L-脯氨酸是冷凍保護劑的理想候選物，因其高溶解度，中性pH、高滲透壓、高濃度下無毒等特點，而被歸類為滲透保護劑和抗氧化劑。有報道稱L-脯氨酸可作為小鼠卵母細胞玻璃化冷凍保護劑，保護線粒體功能，提高玻璃化卵母細胞的存活率[31]。此外，單一或復配的親水性有機溶劑也是玻璃化冷凍保護劑的主要候選物。如ZHOU Chengjie,et al[32]等比較了4 種不同濃度的冷凍保護劑(二甲基亞砜、甘油、乙二醇、丙二醇)，發現使用20%乙二醇+20%二甲基亞砜適用于小鼠卵母細胞的凍存，復蘇后有65.0%±3.5%的卵母細胞存活；SANTOS,et al[33]比較了乙二醇和丙二醇對未成熟豬卵母細胞玻璃化的影響，結果發現35%丙二醇使玻璃化凍存后卵母細胞存活率更高。然而，丙二醇對卵母細胞有很大毒性，對乙二醇和丙二醇進行復配使用時效果較好，如17.5%乙二醇和17.5%丙二醇的組合產生合理的存活率，對胚胎發育損傷較小。

水生動物卵母細胞凍存有其獨特性和技術困難，研究魚卵細胞內水分分布及提高卵膜通透性、使用合適的玻璃化液濃度和降低玻璃化液毒性，是成功凍存魚卵細胞的前提。由于魚類卵母細胞的細胞膜滲透性低，及卵母細胞的高度低溫敏感性，大大影響了魚類卵母細胞玻璃化的研究進展。同時，因為有大量卵黃的存在，影響玻璃化液進入卵細胞，導致魚卵在平衡液中的時間延長，玻璃化液自身毒性可能造成魚卵細胞死亡[34]。

不同品種魚類卵細胞對保護劑的敏感性差異較大。方晨等[35]使用含1.5 mol·L-1甲醇、6.0 mol·L-1乙二醇和0.25 mol·L-1蔗糖的冷凍保護劑，采用兩步平衡法進行平衡后冷凍保存斑馬魚卵母細胞，并在37 ℃復蘇后采用四步洗滌法去除冷凍保護劑，結果表明可得到(48.89±2.58)%的卵母細胞存活率。而Digmayer[36]發現，采用慢速程序降溫(-1 ℃·min-1)策略以及由1.6 mol·L-1甲醇和0.25 mol·L-1蔗糖組成的冷凍保護劑，對大蓋巨脂鯉Colossoma macropomum 卵母細胞進行冷凍保存時，復蘇后可以觀察到具有完整透明帶的卵母細胞，但是無法成功受精。

2.2 無脊椎動物卵母細胞冷凍保存技術

由于卵母細胞，特別是在海洋無脊椎動物的卵母細胞對低溫存在敏感性，因此常用的凍存方法是程序性降溫，使用緩慢的降溫速率或者兩步降溫法，最后將樣品存于液氮保存。相關技術研發一般是針對冷凍保護劑的選擇和比例優化。在海洋無脊椎生物中，最常用的冷凍保護劑是10%乙二醇。TERVIT,et al[37]使用10%乙二醇作為冷凍保護劑，用兩步冷凍法進行凍存后使用28 ℃水浴復蘇太平洋牡蠣Crassostrea gigas卵母細胞得到74.5%的受精率，其中30%發育成擔輪幼蟲；ADAMS,et al[[38]僅改變降溫速率，將太平洋牡蠣的擔輪幼蟲發育率提高到50%。而ADAMS,et al[39]使用與TERVIT 采用的相同冷凍方法和復蘇方法，在冷凍保護劑中添加了0.4 mol·L-1的海藻糖后，復蘇新西蘭綠唇貽貝Perna canaliculus 的擔輪幼蟲率僅有1%。YANG,et al[40]認為使用一步緩慢降溫冷凍法(-1.5 ℃·min-1)配合2 mol·L-1二甲基亞砜作為冷凍保護劑最適宜鮑魚Haliotis diversicolor 卵母細胞的低溫保存，并得到48.8%的卵母細胞存活率和24%的孵化率。目前研究報道的部分卵母細胞冷凍保存方案和活力評估數據見表2。

表2 卵母細胞冷凍保存方案及活力評估舉例Tab.2 Examples in oocyte cryopreservation

3 胚胎冷凍保存技術

胚胎冷凍是繼動物精液冷凍保存后研究成功的又一項細胞冷凍保存技術，從保護的角度考慮，胚胎冷凍具有保留父母雙方遺傳信息的優點。到目前為止，已有數十種動物的胚胎冷凍保存獲得成功，但物種之間的差異使得單一低溫保存技術的推廣應用變得困難重重。這種差異包括不同物種對冷凍保護劑的敏感性不同、最佳胚胎階段不同以及梯度降溫程序不同等。另外，包裹著胚胎的透明帶可以作為天然屏障，阻礙冷凍保護劑在胚胎中自由流動，因此，要實現胚胎冷凍保存的大規模成功，將面臨更多的挑戰。一般認為，影響冷凍胚胎復蘇后活力的主要因素是胚胎的脂類含量，但是，胚胎冷凍和復蘇的速度、胚胎的大小和發育程度、胚胎的滲透特性以及冷凍保護劑的滲透特性和毒性也在很大程度上影響了胚胎的冷凍保存的效果。

3.1 脊椎動物胚胎冷凍保存技術

目前研究認為，不同冷凍保護劑對胚胎凍存影響較大，LIU,et al[41]等用丙二醇、乙二醇和甘油作為冷凍保護劑，并分別評價了慢速冷凍和玻璃化冷凍法對小鼠8 細胞胚胎凍存的影響，結果表明丙二醇更適合8 細胞慢速冷凍，而乙二醇更適合于玻璃化冷凍。不同發育階段的胚胎對冷凍保護劑的耐受性也不相同，已有研究證明，隨著胚胎的發育，大鼠胚胎細胞對冷凍保護劑的耐受性也越來越高，而4 細胞階段和8 細胞階段的小鼠桑葚胚更適合玻璃化凍存[42]。OHAOSHI,et al[43]評價了四種冷凍保護劑(聚乙二醇、牛血清白蛋白、聚乙烯吡咯烷酮和水溶性聚蔗糖)，發現使用兩步法將胚胎暴露于保護劑中，并使用添加聚乙二醇的冷凍保護劑適用于牛胚胎的凍存，有助于提高體外存活率。TIAN,et al[44]比較2 種凍存液(PMG3T、PMG3S)對石斑魚Epinephelus moara 胚胎的影響，發現兩種凍存液均適用于石斑魚胚胎凍存，使用40% PMG3S 復蘇的胚胎存活率更高(63.36%)。

3.2 無脊椎動物胚胎冷凍保存技術

LI Kang,et al[45]評估了螢火蟲Coleoptera：Lampyridae 胚胎玻璃化凍存的三種平衡過程，認為通過三步平衡法并使用添加0.5 mol·L-1海藻糖的冷凍保護劑可以得到更高的胚胎存活率(71.8±2.7)%。GUIGNOT,et al[46]研究了西方蜜蜂Apis mellifera 胚胎的冷凍保存方法，比較了低溫保存前胚胎制備的三個不同條件，并收集了冬季和春季的蜜蜂胚胎，結果顯示超聲波導入法處理胚胎細胞可以使孵化率達到25%，并認為季節對胚胎冷凍保存起到一定影響作用。在海洋無脊椎動物胚胎凍存研究中，確定冷凍保護劑的組合方式同樣是至關重要的。PAREDES,et al[47]對海膽Paracentrotus lividus 胚胎的低溫保存研究首次尋找到適合冷凍海膽卵細胞和胚胎的冷凍保護劑組合，并確定了可以得到更高孵化率的慢速冷凍速率。他們認為最有效的冷凍保護劑組合是1.5 mol·L-1二甲基亞砜加0.04 mol·L-1海藻糖，通過4 ℃初始保持2 min，然后以-1 ℃·min-1冷卻至-12 ℃，此時加入胚胎，保持2 min，再以-1 ℃·min-1至-80 ℃下進行第二次冷卻，最后保持2 min 后，將冷凍管轉移到液氮中儲存，獲得了較為理想的凍存效果。PAREDES,et al[48]還認為，配制海膽胚胎冷凍保護劑需要區別于其他海洋無脊椎動物，不應該使用超純水作為溶劑，使用超純水的實驗組解凍后的胚胎孵化率為零。目前研究報道的部分胚胎冷凍保存方案和活力評估數據見表3。

表3 胚胎冷凍保存方案及活力評估舉例Tab.3 Examples in embryo cryopreservation

4 生殖細胞及胚胎冷凍保存的意義

(1)遺傳育種研究：冷凍精子可以為不同繁殖期或地理間隔的種系交配提供條件，擴大雜交組合的范圍。可以克服雜交育種不能自然交配的困難，為遺傳育種研究長期不間斷地提供精子材料，在性別控制以及以精子作載體生產轉基因物種等方面具有應用價值。

(2)養殖：利用生殖細胞的冷凍技術，可以長期保存野外采集的配子，為野生種和養殖種人工授精提供條件，避免養殖群體近交交配所造成的性狀衰退，達到提純復壯、提高養殖產量的目的。此外，精子冷凍在克服人工繁殖中雌雄親體成熟不同步、擴大苗種生產等方面也很重要。

(3)種質資源保護：通過生殖細胞冷凍保存技術，將一些名貴、優良、瀕危種質的生殖細胞或胚胎，長期、有效地保存起來，即建立種質遺傳庫，用以人工授精所需，可將這些基因資源保存下來，為種質資源保護開辟了一條新的途徑。

生殖細胞的低溫保存具有巨大的科學研發潛力和生產應用價值。目前關于精子凍存的研究已經相對成熟，而對于卵母細胞和胚胎細胞的冷凍保存技術仍需要進一步優化。由于現階段仍缺乏生殖細胞冷凍保存的標準化方法，因此對于從冷凍保存試劑的搭配、平衡液的選擇，到慢速凍存和快速凍存等具體凍存條件等方面的探索，將有助于進一步了解和探索生殖細胞凍存的關鍵科學問題和技術要點，為各物種的活體生理學搭建平臺，也為種質繁育和保存提供一定的理論及實踐參考。