太平洋真寬水蚤CYP4C和CYP44基因克隆及分子特征分析

(國家海洋設施養殖工程技術研究中心，浙江舟山 316022)

浮游動物是海洋生態環境中魚類與其他物種的主要餌料，通過食物鏈聯系初級生產者與更高層次的消費者[1]，在海洋生態系統物質循環和能量流動過程中發揮重要作用[2]。浮游動物種類繁多，包括尾索動物、櫛水母、甲殼動物和輪蟲等。其中，橈足類是浮游動物群落中分布最廣、種類最多的類群。橈足類的生命周期短、對環境變化敏感，可作為研究海洋環境變化和人類活動的指示物種[3]。太平洋真寬水蚤Eurytemora pacifica 是一種暖水性沿岸橈足類，是我國東海沿岸的季節性優勢種[4]，由于食物鏈中的特殊地位使其在海洋環境檢測過程中有重要作用，因此對太平洋真寬水蚤功能基因的研究將有助于了解其生態學重要性及海洋環境變化。

細胞色素酶P450 (Cytochrome P450，CYP450)是以血紅素作為輔因子的一類超家族，是重要的I 相代謝酶[5]。CYP450 酶系廣泛存在生物體不同組織中，發揮不同的生物學作用，例如，參與脂質等內源性化合物的代謝過程[6-8]；參與環境污染物和致癌物質的解毒反應[9-10]。CYP450 超家族基因已在動物、植物、真菌和細菌中被鑒定并廣泛研究(http：//drnelson.uthsc.edu/CytochromeP450.html)。另外，CYP450 超家族被認為是海洋污染的生物標志物[11]。多名學者研究指出在海洋脊椎動物多環芳烴代謝過程中CYP1 基因發揮重要作用[12-14]；KASAI，et al[15]在海洋無脊椎動物中發現CYP4 家族參與其生物代謝和外部污染物的解毒反應；中國學者在多種海洋無脊椎動物中發現CYP4 基因參與污染物的解毒反應[12,16]，如雙齒圍沙蠶Perinereis aibuhitensis、翡翠貽貝Perna viridis 等。但對橈足類中CYP450 家族基因研究較少，因此研究太平洋真寬水蚤CYP450 家族基因將有助于了解橈足類CYP450 家族分子特征，揭示其對環境污染物的解毒代謝機制。

本研究通過RACE 技術首次克隆太平洋真寬水蚤EpCYP4C 和EpCYP44 基因全長序列，并通過生物信息學技術進行序列分析。EpCYP4C 和EpCYP44 基因序列分析結果有助于橈足類CYP450 酶系的研究，為后續研究太平洋真寬水蚤對環境污染物的代謝機制和解毒機理奠定基礎，同時為發現太平洋真寬水蚤的生物學功能提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗所用太平洋真寬水蚤(長約1.2～1.4 mm)來自中國浙江省舟山市長峙島。太平洋真寬水蚤在鹽度28、溫度(20±0.5) ℃且充氧的水槽中暫養7 d，每天定時投喂小球藻。實驗挑選生命力強且健康的太平洋真寬水蚤成體作為研究對象。

1.2 實驗方法

1.2.1 總RNA 提取和反轉錄

本研究選取大約80 只太平洋真寬水蚤成體，用DEPC 水沖洗去除海水殘存的雜質，根據Total RNA Kit II (OMEGA，USA)說明書[17]提取總RNA，并用DNase I (OMEGA，USA)處理。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測RNA 完整性，并通過NanoDrop 2000 核酸蛋白檢測儀測定其濃度。然后按照SuperScriptTMIII 反轉錄酶試劑盒(Invitrogen，USA)說明書，將5 μg 總RNA 反轉錄合成cDNA 第一鏈，并儲存于-20 ℃。

1.2.2 太平洋真寬水蚤CYP4C 和CYP44 基因中間片段的擴增

從實驗室太平洋真寬水蚤轉錄組中[17]獲得CYP4C 和CYP44 基因部分序列，利用primer premier 5.0軟件設計CYP4C 和CYP44 基因特異性引物(表1)，以cDNA 第一鏈作為模板進行聚合酶鏈式(PCR)反應。20 μl PCR 反應體系：cDNA 0.4 μl，EasyTaqDNA Polymerase(全式金，中國)0.4 μl，EasyTaqbuffer 2 μL，上下游引物0.4 μL，10 mM dNTPs 0.4 μL，加DEPC 水至20 μL。PCR 反應程序為預變性(95 ℃，5 min)；變性(95 ℃，30 s)、退火(CYP4C：52 ℃，30 s；CYP44：56 ℃，30 s)、延伸(72 ℃，40 s)，共32 個循環；終延伸(72 ℃，7 min)。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產物，使用普通瓊脂糖凝膠DNA 回收試劑盒(天根,中國)對其進行膠回收，并連接至T 載體，4 ℃過夜。取10 μL 連接產物克隆至DH5α 感受態細胞中(Vazyme,USA)，通過藍白斑篩選獲得陽性克隆子，送至上海華大基因公司測序。

1.2.3 太平洋真寬水蚤CYP4C 和CYP44 基因5’-RACE 和3’-RACE 擴增

表1 RACE 引物信息Tab.1 RACE primer sequences information

1.2.4 太平洋真寬水蚤CYP4C 和CYP44 基因生物信息學分析

通過DNAMAN 軟件拼接太平洋真寬水蚤CYP4C 和CYP44 基因中間序列、5’末端序列和3’末端序列，獲得全長cDNA 序列，命名為EpCYP4C 和EpCYP44。利用MEGA7.0 軟件[18]將EpCYP4C 和EpCYP44基因編碼序列翻譯成氨基酸序列，登錄NCBI 網站用BLAST 分析EpCYP4C 和EpCYP44 氨基酸序列同源性。利用ExPAsy (https：//web.expasy.org/protparam/)在線軟件分析EpCYP4C 和EpCYP44 蛋白質理化性質；通過PROSITE 分析EpCYP4C 和EpCYP44 蛋白質功能位點。另外，利用SMART 在線軟件(http：//smart.embl-heidelberg.de/)預測結構功能域。通過DNAMAN 軟件進行多序列同源性比較。根據相鄰連接(Neighbor-joining,NJ)法[19]構建系統進化樹。利用SOPMA 在線程序(https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html) 預測蛋白質二級結構；通過SWISS-MODEL 軟件(https：//www.swissmodel.expasy.org/)模擬構建蛋白質三維結構。通過PSORT 程序(https：//psort.hgc.jp/form.html)預測蛋白亞細胞定位。

1.3 序列來源

根據EpCYP4C 蛋白BLAST 結果下載其他無脊椎動物基因序列。分別是甲殼綱：近親真寬水蚤(Eurytemora affinis，XM_023478114.1)，加利福尼亞虎斑猛水蚤(Tigriopus kingsejongensis，KY249923.1)，日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus，KF640012.1)，凡納濱對蝦(Litopenaeus vannamei，GU969106.2)，中國明對蝦(Fenneropenaeus chinensis，GU218693.1)，日本對蝦(Marsupenaeus japonicus，KP234017.1)；軟甲綱：三疣梭子蟹(Portunus trituberculatus，JN835470.1)，中華絨螯蟹(Eriocheir sinensis，KX812713.1)；昆蟲綱：寄生蜂(Diachasma alloeum，XM_015264016.1)，阿里山潛蠅繭蜂(Fopius arisanus，XM_011302246.1)，寄生木黃蜂(Orussus abietinus，XM_023432286.1)，雙果蠅(Drosophila bipectinata，XM_017245718.1)，果蠅(Drosophila willistoni，XM_002073483.2)，暗果蠅(Drosophila obscura，XM_022357779.1)，黑腹果蠅(Drosophila melanogaster，NM_079859.4)，波斯果蠅(Drosophila persimilis，XM_002020380.2)，米蘭達果蠅(Drosophila miranda，XM_017284500.1)，雙翅果蠅(Drosophila biarmipes，XM_017095903.1)，麥莖蜂(Cephus cinctus，XM_015734568.2)，銅綠蠅(Lucilia cuprina，XM_023441491.1)，瓜實蠅(Bactrocera cucurbitae，XM_011186956.1)，家蠅(Musca domestica，XM_005185973.3)，桔小實蠅(Bactrocera dorsalis，XM_011216085.2)，白蟻(Cryptotermes secundus，XM_023858360.1)，煙粉虱(Bemisia tabaci，XM_019045778.1)。

根據EpCYP44 蛋白BLAST 比對下載其他無脊椎動物基因序列。分別是甲殼綱：近親真寬水蚤(Eurytemora affinis，XM_023474320.1)，加利福尼亞虎斑猛水蚤(Tigriopus kingsejongensis，KY249925.1)，日本虎斑猛水蚤(Tigriopus japonicus，KF640014.1)，矮小擬鏢水蚤(Paracyclopina nana，KP899600.1)；昆蟲綱：白蟻(Cryptotermes secundus，XM_023847705.1)，濕木白蟻(Zootermopsis nevadensis，XM_022074691.1)，煙粉虱(Bemisia tabaci，XM_019047605.1)，褐飛虱(Nilaparvata lugens，XM_022333163.1)，西花薊馬(Frankliniella occidentalis，XM_026418937.1)，溫帶臭蟲(Cimex lectularius，XM_014404579.2)；內口綱：銻對土壤跳蟲(Folsomia candida，XM_022106671.1)；曳鰓綱：尾曳鰓蟲(Priapulus caudatus，XM_014807126.1)；雙殼綱：美洲牡蠣(Crassostrea virginica，XM_022442025.1)，長牡蠣(Crassostrea gigas，XM_011426803.2)，蝦夷扇貝(Mizuhopecten yessoensis，XM_021492286.1)；尾感器綱：隱桿線蟲(Caenorhabditis briggsae，XM_002630688.1)，秀麗隱桿線蟲(Caenorhabditis elegans，NM_062651.3)，普通隱桿線蟲(Caenorhabditis remanei，XM_003109029.1)；腹足綱：福壽螺(Pomacea canaliculata，XM_025252237.1)，海蝸牛 (Aplysia californica，XM_005097356.2)，光滑雙臍螺(Biomphalaria glabrata，XM_013220438.1)；無鉸綱：鴨嘴海豆芽(Lingula anatina，XM_013564455.1)。

2 結果

2.1 太平洋真寬水蚤CYP4C 和CYP44 基因序列分析

根據DNAMAN 軟件拼接獲得太平洋真寬水蚤EpCYP4C 全長cDNA 序列2 032 bp (GenBank：MK327539)，包括60bp 5’非翻譯區，487 bp 3’非翻譯區，3’末端具有多腺苷酸加尾信號(ATAAA)和poly(A)尾，開放閱讀框(ORF) 1 485 bp，編碼494 個氨基酸(圖1A)。ExPAsy 預測EpCYP4C 基因分子式是C2526H3976N676O738S18，原子總數為7 934，分子量為56.2 kDa；理論等電點為6.34，其中帶負電荷的氨基酸數量(Asp+Glu)是65，帶正電荷的氨基酸數量(Arg+Lys)是61；富含亮氨酸(Leu，11.3%) (表2)，不穩定指數40.34(＞40)，為不穩定蛋白質。PROSITE 在線軟件預測EpCYP4C 蛋白具有CYP4 家族特征序列EVDTFMFEGHDTT (第295—307 位氨基酸)，CYP450 蛋白特有的血紅素結合區FxxGxxxCxG (FSAGPRNCI,第433—442 位氨基酸)，C 螺旋保守區WxxxR (WGSRR,第121—125 位氨基酸) 和K 螺旋保守區ExxR(ESLR,第360—363 位氨基酸) (圖1A)。經SMART 預測發現EpCYP4C 蛋白具有TM 結構域(第2—21 位氨基酸)和p450 結構域(第31—490 位氨基酸)，未發現信號肽(圖1A)。

太平洋真寬水蚤EpCYP44 基因全長1 752 bp (GenBank：MK327540)，其中開放閱讀框1 485 bp，編碼494 個氨基酸，5’非翻譯區85 bp，3’非翻譯區182 bp，3’末端具有多腺苷酸加尾信號(AATAAA)和poly(A)尾(圖1B)。EpCYP44 基因分子式是C2534H3953N675O732S15，原子總數是7909，分子量為56.067 kDa；帶負電荷的氨基酸數量(Asp+Glu)是58，正電荷的氨基酸數量(Arg+Lys)是57，理論等電點為6.88；富含亮氨酸(Leu，11.5%)(表3)，EpCYP44 是不穩定蛋白質(不穩定指數：43.80)。EpCYP44 蛋白具有血紅素結合區保守序列FGHGTRMCAG (第434—443 位氨基酸)，C 螺旋保守區WYKLR (第123—127 位氨基酸)和K 螺旋保守區ETFR (第360—363 位氨基酸)(圖1B)。SMART 預測發現EpCYP44 蛋白具有CYP450 家族成員特有的保守結構域，p450 結構域(第24—490 位氨基酸)，無信號肽(圖1B)。

表2 EpCYP4C 氨基酸組成Tab.2 Amino acid composition of EpCYP4C

表3 EpCYP44 氨基酸組成Tab.3 Amino acid composition of EpCYP44

2.2 CYP4C 和CYP44 蛋白多序列比對

經BLAST 比對發現EpCYP4C 蛋白與近親真寬水蚤CYP4C 蛋白同源性最高，高達81.38%。EpCYP4C蛋白與近親真寬水蚤CYP4C、日本虎斑猛水蚤CYP4V22、加利福尼亞虎斑猛水蚤CYP4V22、中華絨螯蟹CYP4、黑腹果蠅CYP4C3、阿里山潛蠅繭蜂CYP4C3 和中國明對蝦CYP4 的氨基酸序列通過DNAMAN 軟件進行多序列比對。多序列比對結果發現TM 結構域在多個物種間保守性較差，但與近親真寬水蚤氨基酸序列保守性較高；p450 結構域在多物種間的同源性較高；CYP4 家族特征序列和血紅素結合區在進化上是高度保守的(圖2A)。

BLAST 比對發現EpCYP44 蛋白與近親真寬水蚤CYP44 氨基酸序列同源性最高(83.60%)。通過DNAMAN 軟件對EpCYP44 蛋白與近親真寬水蚤CYP44、日本虎斑猛水蚤CYP44D1、加利福尼亞虎斑猛水蚤CYP44D1、美洲牡蠣CYP44、隱桿線蟲CYP44A1、煙粉虱CYP44 和白蟻CYP44 的氨基酸序列進行同源性比對。結果表明EpCYP44 蛋白p450 結構域在多個物種間同源性較高；其血紅素結合區在進化上保守性較高(圖2B)。

圖1 EpCYP4C 和EpCYP44 核苷酸和氨基酸序列分析Fig.1 Nucleotide and amino acid sequences analysis of EpCYP4C and EpCYP44 gene

圖2 不同物種間的蛋白多序列比對Fig.2 Multiple sequence alignment in different species

2.3 CYP4C 和CYP44 氨基酸序列系統進化樹構建

收集來自不同物種的CYP4C 氨基酸序列，根據NJ 法構建系統進化樹。系統進化樹結果顯示，太平洋真寬水蚤CYP4C 與甲殼綱、橈足亞綱物種(近親真寬水蚤、日本虎斑猛水蚤和加利福尼亞虎斑猛水蚤)聚集成1 個單獨的分支；昆蟲綱物種CYP4C3 聚集成1 個分支；中國明對蝦、凡納濱對蝦和日本對蝦與軟甲綱物種聚集成1 個分支(圖3A)。結果分析表明太平洋真寬水蚤CYP4C 和近親真寬水蚤親緣關系更近，同源性更高；與昆蟲綱物種親緣關系較遠(圖3A)。

根據甲殼綱、昆蟲綱、內口綱、曳鰓綱、尾感器綱、腹足綱、無鉸綱和雙殼綱八類物種CYP44 氨基酸序列構建系統進化樹。結果分析發現太平洋真寬水蚤CYP44 先與橈足亞綱物種聚為1 個小分支，然后與內口綱、尾感器綱、昆蟲綱和曳鰓綱四類物種聚為1 個分支，再與腹足綱物種聚為1 個大分支；雙殼綱和無鉸綱兩類物種聚為1 個大分支(圖3B)。結果說明太平洋真寬水蚤CYP44 與近親真寬水蚤同源性更高，親緣關系更近；與雙殼綱物種和無鉸綱的鴨嘴海豆芽親緣關系較遠(圖3B)。

圖3 不同物種氨基酸序列的系統進化樹(NJ 樹)Fig.3 Phylogenetic trees of amino acid sequences from various species (Neighbor-joining)

2.4 EpCYP4C 和EpCYP44 蛋白二級結構與三級結構預測

通過SOPMA 軟件預測EpCYP4C 蛋白二級結構，結果顯示，α 螺旋(h)由235 個氨基酸殘基組成，占二級結構的47.57%；無規則卷曲(c)由181 個氨基酸殘基組成，占二級結構的36.64%；由60 個氨基酸殘基組成的β 折疊(e)和由18 個氨基酸殘基組成的β 轉角(t)，分別占二級結構的12.15%和3.64% (圖4A)；這說明EpCYP4C 蛋白二級結構主要由α 螺旋和無規則卷曲組成。通過SWISS-MODEL 軟件構建EpCYP4C 蛋白三維結構，結果顯示其空間結構由23 個α 螺旋和8 個β 折疊組成(圖4B)。

經SOPMA 預測發現EpCYP44 蛋白二級結構主要由α 螺旋和無規則卷曲組成。α 螺旋(h)由245 個氨基酸殘基組成，占二級結構的49.60%；無規則卷曲(c)由177 個氨基酸殘基組成，占二級結構的35.83%；β轉角(t)和β 折疊(e)分別由23 和49 個氨基酸殘基組成，β 轉角占二級結構的4.66%，β 折疊占二級結構的9.92% (圖4C)。EpCYP44 蛋白三級結構模型顯示由20 個α 螺旋和11 個β 折疊構成(圖4D)。

圖4 EpCYP4C 和EpCYP44 蛋白二級結構與三級結構Fig.4 Secondary structure and three-dimensional structure of EpCYP44 and EpCYP44 protein

2.5 EpCYP4C 和EpCYP44 蛋白亞細胞定位

通過PSORT 程序預測EpCYP4C 和EpCYP44 蛋白亞細胞定位。EpCYP4C 蛋白亞細胞定位預測顯示，分布在細胞質的可能性為39.10%，分布在細胞核的可能性為21.70%，分布在線粒體的可能性為17.40%，分布在內質網的可能性為8.70%，分布在過氧化物酶體、高爾基體和分泌系統囊泡的可能性均為4.30%(圖5A)。另外，亞細胞定位預測發現EpCYP44 蛋白分布在細胞質和線粒體的可能性較大，分別為47.80%和34.80%，分布在細胞核的可能性為8.70%，分布在細胞骨架和分泌系統囊泡的可能性為4.30% (圖5B)。

圖5 EpCYP4C 和EpCYP44 蛋白亞細胞定位Fig.5 The subcellular localization of EpCYP4C and EpCYP44 protein

3 討論

CYP450 超家族廣泛存在于脊椎動物和無脊椎動物等多種生物中[20]，參與動物體內多種藥物的生物轉化[21]，在內源性和外源性化合物代謝過程中發揮重要作用[9]，因此CYP450 酶家族被認為是檢測環境的生物標志物。另外，CYP450 超家族成員眾多，周君霞等學者指出CYP450 超家族包括36 個基因家族，主要是CYP1-CYP44 家族[22]。其中，CYP1-4 家族參與脊椎動物和無脊椎動物的I 相代謝解毒反應[23]，且CYP4 家族是CYP450 酶系的重要家族，國內外多項研究[12,16,24]表明CYP4 家族參與生物解毒代謝過程，例如CYP4家族在哺乳動物內源性底物代謝過程中發揮功能作用[25-26]；在昆蟲中，CYP4 家族參與解毒代謝反應[27]；CYP4 家族在節肢動物中參與蛻皮甾類生物的合成[28]。CYP450 酶系的代謝機制及藥物應用等方面在不同物種中已被廣泛研究[26-29]。

目前，CYP450 酶系在海洋無脊椎動物中也有相關研究，如2010 年發現翡翠貽貝在污染物多氯聯苯暴露下，對性腺中CYP4 基因的表達有顯著的誘導作用[16]；在2017 年對海洋纖毛蟲的研究中發現CYP450家族基因參與苯并芘和β-萘黃酮的解毒作用[30]。然而，橈足類作為魚類等物種的主要餌料[31]，海洋環境變化的指示物種[3]，其CYP450 酶家族的分子特征和解毒機制還尚未明確。本研究通過RACE 技術首次克隆太平洋真寬水蚤EpCYP4C 和EpCYP44 全長cDNA 序列；序列分析發現EpCYP4C 和EpCYP44 蛋白具有CYP450 家族特有的血紅素結合區，屬于CYP450 酶系；而且EpCYP4C 蛋白具有CYP4 家族特有的保守序列，歸類為CYP4 家族，具有TM 結構域，推測其可能是一種膜蛋白；亞細胞定位預測發現EpCYP4C 和EpCYP44 蛋白分布在細胞質和線粒體的可能性較大，這可能與其解毒代謝功能相關。本研究對太平洋真寬水蚤CYP4C 和CYP44 基因的研究既揭示了海洋橈足類CYP450 家族基因的存在，表明海洋橈足類CYP450 家族基因的多樣性；也為后續研究太平洋真寬水蚤EpCYP4C 和EpCYP44 基因的本底表達及在污染物暴露下的表達奠定基礎；更為研究海洋橈足類CYP450 超家族的分子特征提供參考。