響應面法優化金槍魚蛋白抗痛風活性肽制備工藝

李桂芬，何定芬，鄭霖波，張家瑋，葉常青，謝 超

(1.浙江國際海運職業技術學院，浙江舟山 316021；2.浙江海洋大學食品與醫藥學院，浙江舟山 316022；3.舟山市常青海洋食品有限公司，浙江舟山 316022.)

痛風在現代社會中是很常見的一種疾病。人體中的嘌呤類物質經過代謝會產生尿酸，正常情況下其在血液中濃度為200～410 μmol·L-1，男性的尿酸含量一般高于女性[1]。一旦人體血液中尿酸含量過高，就會出現高尿酸敗血癥[2]，從而導致關節等地方出現尿酸鹽結晶的析出沉積，出現痛風的癥狀。血尿酸濃度長時間在高水平，會誘發高血壓[3]、糖尿病[4]及冠心病[5]等各類疾病。黃嘌呤氧化酶（XOD）是人體嘌呤代謝的終端酶和關鍵酶，人體的尿酸濃度在某種程度上可以通過XOD 活性表現，因此測定XOD 活性可以確定尿酸含量水平[6]。COOPER N，et al[7]、GEORGE S K,et al[8]以及李忠琴[9]等人用液相色譜法檢測XOD 活性，還有辣根過氧化物酶法[10]等檢測手段。

國內外研究表明一些生物肽具有抗痛風活性，比如乳清蛋白[11]、糖巨肽和G600 乳脂[12]、鯊魚軟骨[13]等。生物活性肽一般由四種途徑產生，天然生物活性肽、人工合成肽、蛋白水解肽以及微生物發酵制備肽，蛋白水解肽是獲得生物活性肽最重要也是最普遍的手段[6]。多肽因其特殊性，有很廣的應用范圍，研究具有抗痛風、防治高尿酸血癥作用的生物活性肽有很高的社會價值。

金槍魚（Thunnus），別名吞拿魚，屬硬骨魚綱、驢形目、金槍魚屬[14]，是一種生活在熱溫帶海域的洄游魚類，各大海域均有分布[15]。金槍魚具有很高的營養價值，富含多種不飽和脂肪酸，非常適合食用以補充人體所需的營養[16]。本文以金槍魚為原料，通過單因素實驗結合響應面法優化復合酶解工藝參數，獲得金槍魚抗痛風活性肽，為研究抗痛風活性肽提供理論依據，具有一定的社會價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

金槍魚，舟山市常青海洋食品有限公司提供。將金槍魚去除頭部以及內臟之后置于絞肉機中得到金槍魚魚糜，收集分裝魚糜置于-20 ℃冰箱中凍藏。實驗開始前4 h 取出在室溫下解凍備用。

中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶以及堿性蛋白酶均購于南寧東恒華道生物科技有限責任公司。

磷酸二氫鉀，磷酸氫二鈉，磷酸二氫鈉，磷酸二氫氨，乙酸銨鹽酸，均為分析純，購于國藥集團化學試劑有限公司。

黃嘌呤，黃嘌呤氧化酶，尿酸，別嘌呤醇，甲醇，均為色譜純，購于美國Sigma 公司。

1.2 儀器與設備

儀器與設備見表1。

表1 儀器與設備Tab.1 Instruments and equipment

1.3 方法

1.3.1 金槍魚生物肽的制備

取解凍好的金槍魚魚糜20 g，加至100 g 去離子水中，調節溶液的pH，達到加入蛋白酶的最適pH 值，加入0.2 g·100-1·mL-1[17]的蛋白酶進行酶解，酶解溫度均控制在45 ℃，酶解完成后水浴加熱至95 ℃持續15 min進行滅酶[18]。冷卻后去酶解液10 000 r·min-1離心10 min，取上清液置于10 mL 離心管中密封，放置于-20℃的冰箱中保存備用。

1.3.2 蛋白回收率測定

采用凱氏定氮法[19]測定金槍魚魚糜與上清液中總氮。蛋白回收率計算公式如下：

蛋白回收率=（m上清液×N上清液）÷（m魚糜×N魚糜）

m上清液：上清液質量；N上清液：上清液N 元素含量；m魚糜：魚糜質量；N魚糜：魚糜N 元素含量。

1.3.3 黃嘌呤氧化酶（XOD）抑制活性測定

1.3.3.1 配制溶液：

磷酸緩沖液（PBS）：分別稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）和磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）30.083 8 g及2.4962 g，加入超純水后定容至500 mL。

黃嘌呤：6.4 mg 黃嘌呤溶解于1 mL NaOH 中，再加入100 mL PBS 溶液，調節pH 至7.5。

黃嘌呤氧化酶：抽取120 μL 黃嘌呤氧化酶液，加入PBS 至10 mL。

流動相：0.015 mol·L-1磷酸二氫胺溶液。

1.3.3.2 預處理

稀釋樣品到50 mg·mL-1，實驗組為50 μL 樣品與150 μL 黃嘌呤混合液，對照組為50 μL PBS 與150 μL黃嘌呤混合液，全部置于酶標板中，均做3 個平行組。在恒溫30 ℃下靜置10 min，隨后加入黃嘌呤氧化酶50 μL，從加入時開始計時，每間隔30 s 測一次吸光值，持續測試50 次。測量結束后加入高濃度HCl 使反應終止，取反應液用去離子水稀釋10 倍后過水性膜，保存反應液。

1.3.3.3 尿酸生成量

色譜柱：戴安DIONEX-IonPac 離子色譜柱（5 μm，4.0×250 mm）

液相條件：洗脫液為15%甲醇85%磷酸二氫胺混合溶液，進樣體積為20 μL，流速1 mL·min-1，檢測波長為290 nm，運行時間15 min[6]。

1.3.3.4 結果分析

XOD 抑制率=1-（對照組尿酸峰面積÷樣品組尿酸峰面積）

1.3.4 酶的篩選

選取中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胃蛋白酶、胰蛋白酶以及堿性蛋白酶五種蛋白酶，在各酶最適酶解條件下分別進行單酶酶解，反應相同時間（6 h）獲得酶解液，測定酶解液的蛋白回收率和XOD 抑制率，對比確定最佳的2 種蛋白酶。選取兩種最佳蛋白酶后進行復合酶解，復合比例為1：1，料液比1：2。

1.3.5 單因素實驗

在用復合酶酶解魚糜時會有許多因素影響酶解的過程，本實驗選取其中3 個對實驗影響較大的因素進行單因素實驗，分別是酶解溫度、加酶量以及酶解時間。通過對3 個因素的單獨考察，測定其蛋白回收率和XOD 抑制率，得到最優的酶解單因素條件。

1.3.6 響應面試驗設計

利用響應面試驗對多個因素進行擬合實驗，通過響應值的對比，從而獲得最佳的復合酶解條件。本實驗選取的3 個因素為酶解溫度、加酶量以及酶解時間，響應值為蛋白回收率及XOD 抑制率，使用Design-Expert 10.0 軟件進行響應面分析。

1.3.7 分子量測定

參照袁蕊[20]液相色譜法測定。

2 結果與分析

2.1 酶的篩選

圖1 展現了不同種類的蛋白酶在酶解金槍魚糜時呈現的不同效果。觀察圖1-a 可以看出，在酶解時蛋白回收率較高的是中性蛋白酶、胰蛋白酶和堿性蛋白酶；圖1-b 為XOD 抑制率，其中表現較好的中性蛋白酶、木瓜蛋白酶和胰蛋白酶。綜合上述，最終選擇中性蛋白酶和胰蛋白酶作為復合酶對金槍魚進行酶解，復合比例1：1，復合酶解時pH 為7.5。

圖1 不同蛋白酶對酶解效果的影響Fig.1 The influence of different proteases on the enzymatic hydrolysis

2.2 單因素試驗

2.2.1 復合酶酶解溫度

復合酶解條件：復合酶酶解時間6 h，加酶量900 U·g-1。自變量為復合酶酶解溫度35.0、37.5、40.0、42.5、45.0、47.5、50.0、52.5、55.0 ℃，實驗結果見圖2。

圖2 復合酶解溫度對酶解效果的影響Fig.2 The effect of compound enzymolysis temperature on the enzymolysis effect

圖2 所示為復合酶解時不同的酶解溫度對酶解效果的影響。分析圖2-a，可以發現當酶解溫度較低35 ℃時，蛋白回收率只有43.62%，此時因為酶解環境溫度低，酶活力下降導致酶解反應速率下降；之后隨著溫度的升高，酶活性上升推動酶促反應加快，在45 ℃時蛋白回收率達到最大值82.54%；繼續升溫后蛋白回收率則出現下降趨勢，分析原因可能是溫度過高導致部分酶失去活性，導致酶促反應下降。圖2-b 反映了酶解溫度變化時XOD 抑制率的變化，其變化趨勢與蛋白回收率相似，其原因可能是具有XOD 抑制效果的肽在酶解效果較差時沒有被酶解得到導致抑制率降低，當酶解效果較好時此類肽增多，提高了XOD抑制率。綜合上述，得到復合酶解最佳溫度為45 ℃。

2.2.2 復合酶酶解加酶量

復合酶解條件：復合酶酶解時間6 h，酶解溫度45 ℃。自變量為復合酶加酶量150、300、450、600、750、900、1 050、1 200、1 350 U·g-1，實驗結果見圖3。

圖3 不同復合酶加酶量對酶解效果的影響Fig.3 The effect of different compound enzymes on the enzymatic hydrolysis effect

從圖3 可以看出，隨著加酶量的增多，蛋白回收率以及XOD 抑制率也隨之提高，在加酶量到達900 U·g-1后蛋白回收率基本不再發生變化，而XOD 抑制率則出現了下降的趨勢?？赡苁钱敿用噶枯^低時，酶含量少，酶促反應速率很低，從而蛋白回收率以及XOD 抑制率都處于較低水平；當加酶量到達900 U·g-1后，游離氨基態氮含量處于飽和狀態，酶促反應速率基本不再變化；然而繼續添加蛋白酶后，過量的蛋白酶會影響XOD 抑制肽的活性，同時也讓酶解液顏色加深，出現不良氣味[21]。因此，最佳的酶添加量為900 U·g-1。

2.2.3 復合酶酶解時間

復合酶解條件：復合酶酶解加酶量900 U·g-1，酶解溫度45 ℃。自變量為復合酶酶解時間4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0 h，試驗結果見圖4。

圖4 不同復合酶解時間對酶解效果的影響Fig.4 The effect of different compound digestion time on the digestion effect

圖4-a 為不同復合酶酶解時間對蛋白回收率的影響。從圖中可以看出，當酶解時間為4 h 時因酶解時間不足，蛋白回收率只有35.62%，當酶解時間延長，底物被充分反應，蛋白回收率不斷提高，當酶解時間達到6 h 之后變緩，基本不再升高，此時游離氨基酸基本飽和。分析圖4-b，前期隨著酶解時間的延長有XOD抑制活性肽在不斷被析出，增加了XOD 抑制率，在6.5 h 時達到最大抑制率43.24%；但是隨著時間繼續延長，抑制率出現了明顯的下降，可能是隨著時間的延長，酶促反應在不斷進行，抑制活性肽又被水解成了更短的肽鏈，從而失去了抑制性。結合兩者，得出最佳的酶解時間為6.5 h。

2.3 響應面優化

2.3.1 響應面設計方案及結果

根據單因素實驗結果，進行響應面優化試驗設計，設計結果見表2，試驗結果見表3。

表2 響應面設計因素及水平Tab.2 Design factors and levels of response surface

表3 響應面設計結果Tab.3 Design results of response surface

2.3.2 回歸方程建立及方差分析

利用軟件分析表3 中的數據，得到回歸方程：

Y1=84.2+0.74A+1.18B+0.69C+0.86AB-0.12AC-0.65BC-2.3A2-1.83B2-0.46C2

式中系數數值的大小表示對蛋白回收率的影響大小，而符號表示該因素的影響方向。蛋白回收率回歸模型方差分析見表4。

表4 蛋白回收率回歸模型方差分析Tab.4 Variance analysis of regression model of protein recovery

表中顯示該模型P＜0.000 1，水平為極顯著模型，R2=0.983 1 且失擬項2.51 遠大于0.05，證明該模型有很好的模擬效果，貼合實際實驗，擬合效果好，可以作為復合酶解金槍魚糜過程中蛋白回收率的預測和分析工具。同時該模型的矯正決定系數R2Adj=0.968 0 遠大于0.8，變異系數CV=0.64%，進一步表明該模型擬合的可靠性，能夠真實的反映實驗值。分析表中各因素均方以及P 值可得，蛋白回收率的因素影響順序為：加酶量＞復合酶解溫度＞復合酶解時間。復合酶解溫度和加酶量的二次項均極顯著（P＜0.000 1），復合酶解時間的二次項為顯著（P＜0.05），觀察交互項顯著性則說明存在一定的互相影響。

利用軟件分析表3 中的數據，得到回歸方程：

Y2=43.13+0.47A-0.013B-0.34C+0.32AB+0.18AC-0.044BC-0.86A2-0.81B2-1.59C2

式中系數數值的大小表示對XOD 抑制率的影響大小，而符號表示該因素的影響方向。XOD 抑制率回歸模型方差分析見表5。

表5 XOD 抑制率回歸模型方差分析Tab.5 XOD inhibition rate regression model analysis of variance

分析表5 可知，該模型為極顯著模型（P＜0.000 1），R2=0.960 0，失擬項為2.17，矯正決定系數R2Adj=0.924 0，變異系數CV=1.16%，說明該模型總體擬合程度高，各因素與響應值之間存在明確的線性關系，具有相當高的準確性，能夠很好的結合試驗預測分析復合酶解金槍魚糜的過程中XOD 抑制率的變化。根據表中數據，對XOD 抑制率影響最大的是復合酶解溫度，其次是復合酶解時間，影響最小的是加酶量。三個因素的二次項均表現為極顯著（P＜0.000 1），三個交互項的影響水平均為不顯著。

圖5 蛋白回收率和XOD 抑制率響應面分析Fig.5 Response surface analysis of protein recovery and XOD inhibition rate

圖5 揭示了交互項之間的相互作用對蛋白回收率和XOD 抑制率的影響[22]。根據響應面優化分析可知，該復合酶解工藝的最佳條件為：復合酶解溫度45.616 1 ℃，加酶量936.594 U·g-1，復合酶解時間6.504 7 h，此條件下蛋白回收率預測值為84.474 3%，XOD 抑制率預測值為43.162 6%。

2.3.3 響應面最佳條件驗證

根據實際可操作性，優化酶解條件為：復合酶解溫度45.5 ℃，加酶量935 U·g-1，復合酶解時間6.5 h。在此條件下最終實驗測得蛋白回收率為83.46%，與預測值偏差1.2%；XOD 抑制率為43.51%，與預測值偏差0.8%，證明該模型擬合度高，優化作用有效。最終復合酶解后蛋白回收率相比單一蛋白酶酶解最高值提高了36.1%，XOD 抑制率提高了54.4%，證明相比于單酶酶解工藝，復合酶解工藝對提高蛋白回收率和XOD 抑制率非常有效。

2.4 分子量分布

對酶解前后的金槍魚進行分子量測定，研究其變化，測定結果見圖6。

分析圖6 可得，金槍魚在沒有經過酶解時大分子（KDa＞10）占比達到了37.29%，而經過酶解后只剩3.45%，降低了90.7%，其余肽段的含量經過酶解后均有上升，在＜3 KDa 此肽段含量達到了78.55%，其中（1～3）KDa 段含量為42.57%，＜1 KDa 肽段含量為35.98%，此時XOD 抑制率水平較高，說明小分子肽很可能具有XOD 抑制活性，目前國內外研究熱點也集中在小分子肽，證實小分子肽具有更多樣的生物活性[23]。

3 結論

本文以金槍魚為研究對象，優化了金槍魚抗痛風活性肽的酶解制備工藝，同時進行了分子量測定。通過實驗得到復合酶組合為中性蛋白酶加胰蛋白酶，再通過響應面優化設計得出最佳復合酶解工藝條件為：復合酶解溫度45.5 ℃，加酶量935 U·g-1，復合酶解時間6.5 h。在此條件下實驗測得蛋白回收率為83.46%，與預測值偏差1.2%，相比單蛋白酶酶解提高36.1%；XOD 抑制率為43.51%，與預測值偏差0.8%，相比單蛋白酶酶解提高54.4%，證明相比于單酶酶解工藝，此復合酶解工藝能夠酶解得到更多的抗痛風活性肽。酶解后酶解液的肽主要為小分子肽，在＜3 KDa 肽段含量達到78.55%，其中（1～3）KDa 肽段含量為42.57%，＜1 KDa 肽段含量為35.98%，大分子肽含量相比于未酶解時降低了90.7%，證明小分子肽具有較高的抗痛風活性。本文為金槍魚抗痛風活性肽的全面研究提供了一定的理論基礎。

本研究對金槍魚抗痛風活性肽的酶解工藝和XOD 抑制率進行了研究，但是針對抗痛風的機理并未深入探討。在本研究基礎上繼續研究抗痛風活性肽，結合食品藥品領域的研究，將會帶來一定的社會效益及經濟效益。