結(jié)核分枝桿菌Hsp60影響小鼠巨噬細胞抗原提呈相關(guān)分子表達的研究①

李 茂 張焱皓 黃 波 李娜娜 羅軍敏 鄢仁晴

(遵義醫(yī)科大學附屬醫(yī)院,遵義醫(yī)科大學免疫學教研室，遵義 563000)

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌復合群(mycobacte-rium tuberculosis complex，MTB)引起的慢性感染性疾病。2018年WHO估算全球范圍內(nèi)新發(fā)結(jié)核病例達1 010萬，我國新發(fā)病例為93萬，發(fā)病率位居全球第三[1]。開展結(jié)核桿菌致病機理的研究及有效控制結(jié)核病的散發(fā)及流行意義重大。結(jié)核分枝桿菌感染的清除由機體的固有免疫和適應性免疫共同介導，固有免疫由位于抗原提呈細胞表面或胞漿的模式識別受體激活，其激活的抗原提呈作用和細胞因子的分泌作用為誘導適應性免疫應答所必需[2]。熱休克蛋白60(heat shock protein 60，Hsp60)可作為危險信號誘發(fā)機體的免疫應答，這與抗原的提呈、淋巴細胞與巨噬細胞的活化有關(guān)[3]。Panayi等[4]發(fā)現(xiàn)被結(jié)核分枝桿菌感染后Hsp60在宿主巨噬細胞中表達量增加，過量的Hsp60可能會干擾結(jié)核感染者巨噬細胞的抗原提呈及相關(guān)分子的表達。

本實驗采用MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細胞，然后檢測MHCⅡ類分子，以了解其對小鼠骨髓巨噬細胞抗原提呈相關(guān)分子表達的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 20只SPF級健康雌性BALB/c小鼠，購自長沙市天勤生物技術(shù)有限公司，生產(chǎn)證號：SCXK(湘)2014-0011,周齡6～8周，體質(zhì)量16～20 g，所有小鼠飼養(yǎng)于22～26℃，相對濕度40%～80%，明暗交替12 h的環(huán)境中，潔凈飲水和標準飼料自由飲食，倫理聲明：所有動物及實驗依照Animal Care and Use of Laboratory Animals(Ministry of Health，China，1998)的指導進行，并通過本校實驗動物和使用倫理委員會批準。

1.1.2實驗試劑 GM-CSF購自NOVUS公司，PCR相關(guān)試劑購自TaKaRa公司,DMEM低糖培養(yǎng)基購自Gibco公司，胎牛血清購自MRC公司。MTB Hsp60序列由北京六合華大基因科技有限公司提供，合成1 620 bp的Hsp60基因片段，連接到pE/T28a載體上，然后用大腸桿菌BL/21菌株表達系統(tǒng)表達目的蛋白。配制濃度分別為：50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml。FITC標記的F4/80、PE標記的MHCⅡ、PECY5標記的CD86以及相同熒光標記的同型對照均購自美國BD公司。

1.1.3實驗儀器 C1000TMThermal cycler熒光定量PCR儀，S1000TMThermal cycler PCR儀，GelDocXR+凝膠成像分析系統(tǒng)為美國Bio-Rad公司產(chǎn)品，Carestream 4000MM PRO為加拿大Carestream Health公司產(chǎn)品，流式細胞儀FACScan為BD公司產(chǎn)品。

1.2方法

1.2.1小鼠骨髓巨噬細胞培養(yǎng) 取6～8周齡BALB/c小鼠，脫頸處死并開放髓腔，用DMEM完全培養(yǎng)基沖洗骨髓腔至骨質(zhì)透白，沖洗液即細胞懸液，將沖洗液粗過濾、離心、裂解、洗滌、重懸，即得到小鼠骨髓來源單細胞懸液；加入10% FBS的DMEM培養(yǎng)液調(diào)整細胞密度至1×106個/ml，鋪于6孔板中，加入20 ng/ml GM-CSF，置于37℃、5% CO2條件下培養(yǎng)；培養(yǎng)至第3天時，用2 ml含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基和 GM-CSF培養(yǎng)液換液；培養(yǎng)至第7天時，貼壁細胞即為骨髓巨噬細胞。加入終濃度分別為50 ng/ml、100 ng/ml、200 ng/ml的MTB Hsp60刺激巨噬細胞。

1.2.2Real-time PCR法檢測相關(guān)分子的表達水平 取上述骨髓巨噬細胞，按照試劑盒說明書提取總RNA。采用紫外分光光度儀測定所提RNA濃度和純度。以總RNA為模板，Oligo(dt)為引物，mRNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA，進行程序擴增，反應體系:ddH2O 8.5 μl，SYBR 12.5 μl，cDNA 2 μl，上下游引物(表1) 各1 μl，總體積25 μl。反應參數(shù)：5℃，10 min；95℃，15 s；60℃，30 s；39個循環(huán)。實驗數(shù)據(jù)用 2- ΔΔCt法(Ct為熒光達到閾值時所需 PCR的循環(huán)數(shù))分析各處理組細胞內(nèi)PⅠ、PⅣ、PⅢ、PⅣ、CⅡTA、IL-27的相對表達量。

表1 Real-time PCR的引物序列

1.2.3F4/80、MHCⅡ、CD86表達檢測 分別吸取100 μl細胞懸液,加入 10 μl FITC-F4/80、PE-MHCⅡ,然后再分別加入10 μl PECY5-CD86單克隆抗體,室溫下避光孵育 15～20 min,加入20 μl 0.5%甲醛固定,流式細胞儀檢測。

1.3統(tǒng)計學分析 所有資料采用SPSS17.0軟件進行統(tǒng)計分析。采用單因素方差分析兩種濃度不同時間點的PCR數(shù)據(jù)差異，采用單因素方差分析3種濃度刺激后流式分析的數(shù)據(jù)差異，采用獨立樣本t檢驗分析同一時間不同濃度間PCR數(shù)據(jù)差異。指標在3個時間點的總體比較以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義，3個時間點兩兩比較以P<0.017表示差異有統(tǒng)計學意義,兩種濃度同一時間比較以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1兩種濃度MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細胞后相關(guān)分子mRNA表達情況 在體外培養(yǎng)條件下，50 ng/ml與100 ng/ml Hsp60分別刺激小鼠骨髓巨噬細胞后取貼壁細胞進行Real-time PCR檢測不同濃度以及不同時間點細胞因子mRNA相對表達水平，測得RNA濃度為422.4 ng/μl，RNA純度為1.91，濃度和純度均適合做PCR。結(jié)果顯示，50 ng/ml MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細胞后CⅡTA、PⅣ、IL-27、PⅠ在3個時間點的mRNA表達水平比較，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，3個時間點兩兩比較，CⅡTA在72 h的表達與24 h的表達相比明顯降低(P<0.017)，PⅣ在48 h的表達與24 h的表達相比明顯降低(P<0.017)，IL-27在48 h的表達與24 h的表達相比明顯降低(P<0.017)，72 h的表達與24 h的表達相比明顯升高(P<0.017)，PⅠ在48 h的表達與24 h的表達相比明顯降低(P<0.017)。見表2～4。100 ng/ml MTB Hsp60刺激后CⅡTA、IL-27、PⅠ在3個時間點的總體比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，3個時間點兩兩比較，IL-27在48 h、72 h的表達與24 h的表達相比明顯升高(P<0.017)，PⅠ在72 h、48 h的表達與24 h的表達相比明顯升高(P<0.017)。100 ng/ml MTB Hsp60刺激后的PⅢ、PⅠ、CⅡTA的mRNA表達水平與50 ng/ml刺激后相比明顯降低(P<0.05)，而PⅣ的mRNA表達水平均明顯升高(P<0.05)。結(jié)果見表2～4。

表2 兩種濃度Hsp60三個時間點刺激的基因表達結(jié)果(2-ΔΔCT)

表3 三個時間點兩種濃度Hsp60刺激的基因表達結(jié)果(2-ΔΔCT)

表4 兩種濃度Hsp60刺激的基因表達結(jié)果(2-ΔΔCT)

2.2比較不同濃度MTB Hsp60刺激后MHCⅡ/F4/80、CD86/F4/80的差異 200 ng/ml MTB Hsp60刺激后MHCⅡ/F4/80的表達百分比明顯低于50 ng/ml 刺激后的水平，而CD86/F4/80的表達百分比明顯增高(P<0.05)。在3組不同濃度指標變化比較中，MHCⅡ/F4/80的表達百分比均明顯高于CD86/F4/80(P<0.05)，結(jié)果見表5、圖1。

表5 不同濃度Hsp60刺激后MHCⅡ/F4/80、CD86/F4/80的流式分析百分比(%)

圖1 不同濃度MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細胞各指標表達情況Fig.1 Indexs expression status of bone marrow of mice macrophages by different concentrations of MTB Hsp60 stimulatedNote:A.Expression of MHC Ⅱ/F4/80 and CD86/F4/80 after stimulation of bone marrow of mice macrophages with 50 ng/ml MTB Hsp60;B.MHCⅡ/F4/80,CD86/F4/80 isotype control after 50 ng/ml MTB Hsp60 stimulated bone marrow of mice macrophages;C.Negative control group of MHCⅡ/F4/80 and CD86/F4/80 after 50 ng/ml MTB Hsp60 stimulated bone marrow of mice macrophages;D.Expression of MHCⅡ/F4/80 and CD86/F4/80 after stimulation of bone marrow of mice macrophages with 100 ng/ml MTB Hsp60;E.Expression of MHCⅡ/F4/80 and CD86/F4/80 after stimulation of bone marrow of mice macrophages with 200 ng/ml MTB Hsp60.

3 討論

巨噬細胞是MTB的主要抗原提呈細胞[5]。MTB基因組攜帶2組Groel基因，分別編碼Groel1和Groel2蛋白，而Groel1是Hsp60蛋白的擬似物。結(jié)核桿菌與Groel1結(jié)合成的肽復合物被巨噬細胞識別吞噬后，降解加工成為具有免疫原性的小分子肽段，部分肽段與MHCⅡ類分子CD80、CD86結(jié)合后轉(zhuǎn)運至巨噬細胞表面表達，激活CD4 T細胞進一步調(diào)節(jié)巨噬細胞的功能。某些MTB與Groel1結(jié)合的肽復合物被巨噬細胞降解與MHCⅠ類分子結(jié)合，進入高爾基體經(jīng)糖化修飾后轉(zhuǎn)運至巨噬細胞表面，被CD8 T細胞識別，通過裂解或誘導巨噬細胞凋亡而發(fā)揮殺菌活性。

反式激活因子CⅡTA被認為是MHCⅡ類分子表達最關(guān)鍵的調(diào)控分子，其表達水平與MHCⅡ類分子的轉(zhuǎn)錄水平呈正相關(guān)。PⅠ、PⅢ和PⅣ是CⅡTA的表達調(diào)控轉(zhuǎn)錄的啟動子，巨噬細胞需3個啟動子共同調(diào)控CⅡTA的轉(zhuǎn)錄。IL-27是IL-12家族細胞因子，廣泛作用于不同類型的細胞而發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用，能夠誘導單核細胞CⅡTA和MHCⅡ類分子的表達。F4/80即小鼠含生長因子樣模體黏液樣激素樣受體，是巨噬細胞表面的特異性抗原，參與巨噬細胞的成熟和活化過程。CD86分子是抗原提呈細胞 (antigen presenting cell,APC)重要的共刺激分子，以單體的形式表達于APC表面。

本研究顯示在兩種不同濃度MTB Hsp60刺激小鼠巨噬細胞后CⅡTA的表達明顯降低(P<0.05)，且在24 h、48 h也有所降低(P<0.05)，50 ng/ml MTB Hsp60刺激后CⅡTA在72 h的表達與24 h的表達相比明顯降低(P<0.05)，提示MTB Hsp60作用于小鼠骨髓巨噬細胞的時間越長，濃度越高，CⅡTA降低越明顯。因此MTB Hsp60刺激后CⅡTA不能正常啟動MHCⅡ基因的轉(zhuǎn)錄，MHCⅡ基因不能正常向CD4+T細胞表達外來抗原，也就是適應性免疫不能正常啟動。王翠妮等[6]報道MTB刺激鼠巨噬細胞后細胞懸液的CⅡTA及其啟動子PⅠ、PⅢ和PⅣmRNA相對表達水平降低。CⅡTA的變化通過降低原發(fā)性縱隔淋巴瘤中MHCⅡ類分子的表達實現(xiàn)免疫逃逸[7]，這與本研究中 Hsp60蛋白刺激后CⅡTA的變化相符，提示MTB Hsp60可能通過降低CⅡTA啟動子的轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)巨噬細胞表面 MHCⅡ類分子的表達，從而實現(xiàn)免疫逃逸。

MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細胞后，PⅠ在不同濃度刺激后3個時間點的總體比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，50 ng/ml MTB Hsp60刺激后PⅠ在48 h的表達與24 h的表達相比明顯降低(P<0.05)，100 ng/ml MTB Hsp60刺激后PⅠ在72 h、48 h 的表達與24 h的表達相比明顯增高(P<0.05)。結(jié)果提示在不同時間不同濃度MTB Hsp60刺激可上調(diào)或下調(diào)PⅠ在小鼠巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄水平。Pacis等[8]報道PⅠ控制樹突細胞的MHCⅡ的構(gòu)成性表達,Hsp60的刺激影響了樹突細胞的甲基化導致PⅠ表達上調(diào)。PⅠ是CⅡTA的表達調(diào)控轉(zhuǎn)錄的啟動子，本研究中PⅠ與CⅡTA的下降反應一致，但是在不同濃度和時間表現(xiàn)出不同轉(zhuǎn)錄變化，是否有甲基化或者其他影響還需進一步的研究。MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細胞，PⅢ在100 ng/ml MTB Hsp60刺激后與50 ng/ml刺激后相比其mRNA表達水平有所降低(P<0.05)，而PⅣ的mRNA表達水平升高(P<0.05)。50 ng/ml MTB Hsp60刺激后PⅣ在3個時間點的總體比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，3個時間點兩兩比較，結(jié)果顯示PⅣ在48 h的表達與24 h 的表達相比明顯降低(P<0.05)，提示高濃度MTB Hsp60可下調(diào)PⅢ在巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄水平，表明PⅢ與CⅡTA的下降反應一致；高濃度MTB Hsp60上調(diào)PⅣ在巨噬細胞的轉(zhuǎn)錄水平，且PⅣ在低濃度刺激的時間越長，降低越明顯，提示PⅣ對MTB Hsp60的刺激在巨噬細胞中表現(xiàn)出不同的的轉(zhuǎn)錄水平，PⅣ的表達隨時間延長而下調(diào)，其對不同濃度刺激表現(xiàn)出不同表達水平的原因有待進一步研究。Chang等[9]認為MTB干擾 MHCⅡ類分子的表達合成，能持續(xù)抑制抗原的提呈，以逃避免疫監(jiān)視而建立潛伏感染。這與本研究結(jié)果大致相符。其可能的原因是巨噬細胞內(nèi)MTB不能被完全清除而產(chǎn)生免疫逃逸，MTB Hsp60抑制小鼠巨噬細胞的抗原提呈功能。

IL-27上調(diào)內(nèi)皮細胞中MHCⅡ類和MHCⅠ類分子的表達,可增強THP-1細胞表面共刺激分子CD80和CD86及黏附分子CD54的表達,表明IL-27可促進單核巨噬細胞的抗原提呈功能[10]。本研究中MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細胞，50 ng/ml MTB Hsp60刺激后IL-27 mRNA表達水平在3個時間點的總體比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，IL-27的mRNA表達水平在48 h刺激后與24 h刺激后相比明顯降低(P<0.017)，而72 h刺激后與24 h刺激后的表達相比有明顯升高(P<0.017)；100 ng/ml MTB Hsp60刺激后IL-27 mRNA在3個時間點的總體比較差異有統(tǒng)計學意義，3個時間點兩兩比較，結(jié)果顯示IL-27 mRNA在48 h、72 h比24 h的表達有明顯升高(P<0.05)。提示MTB Hsp60可以刺激小鼠骨髓巨噬細胞分泌IL-27且隨著刺激濃度增加和時間延長而增高，表明MTB Hsp60能促進巨噬細胞中IL-27轉(zhuǎn)錄，從而正向調(diào)控IL-27的產(chǎn)生。巨噬細胞受 MTB 刺激后可分泌 IL-27，在MTB感染中主要表現(xiàn)出抑制巨噬細胞固有免疫應答[11]，抑制細胞自噬作用，進而導致 MTB 在胞內(nèi)長期存在。IL-27在結(jié)核菌感染過程中發(fā)揮雙重作用，雖然阻止了抗結(jié)核菌的保護性免疫反應，但可以限制慢性炎癥造成的最終病理損害[12]。這些結(jié)果將有助于進一步了解Hsp60和IL-27在固有免疫中抗原提呈反應中的調(diào)控機理,并為疫苗研制提供潛在的靶點。

本研究中，MHCⅡ/F4/80百分比在3個濃度的比較差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)，MHCⅡ/F4/80在200 ng/ml處理組的表達水平明顯低于50 ng/ml處理組，而CD86/F4/80在200 ng/ml處理組的表達水平明顯高于50 ng/ml處理組，差異有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。提示MTB Hsp60刺激濃度越高，小鼠骨髓巨噬細胞MHCⅡ的表達降低越明顯，CⅡTA是調(diào)控MHCⅡ類分子轉(zhuǎn)錄表達的最重要因子，決定 MHCⅡ類分子的表達水平。在本研究中CⅡTA啟動子受MTB Hsp60刺激后其轉(zhuǎn)錄水平下調(diào)，因而巨噬細胞表面 MHCⅡ類分子的表達降低。Aravindhan等[13]發(fā)現(xiàn)Groel1操縱子控制了分枝桿菌中Groel1的表達，在巨噬細胞感染時可迅速上調(diào)。Groel1可能誘導激活巨噬細胞且通過TLR-4介導的信號途徑調(diào)控巨噬細胞抗原提呈功能，參與MTB的慢性感染過程[14]。本研究中MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細胞后共刺激分子CD86明顯升高，這與Riffo等[15]報道Hsp60作為抗感染因素明顯影響?zhàn)じ椒肿拥谋磉_相符。有研究報道TLR7和 TLR9影響小鼠骨髓巨噬細胞抗原提呈功能從而影響 MHCⅡ和CD86表達[16]。也就是說MTB Hsp60刺激后會抑制小鼠骨髓巨噬細胞MHC類抗原MHCⅡ表達，從而影響抗原提呈功能，這可能是MTB逃避宿主保護性免疫反應的主要機制之一。

本課題組前期研究顯示結(jié)核病潛伏感染患者與肺結(jié)核患者外周血Groel1蛋白與一氧化氮合酶(inducible nitric oxide synthase,iNOS)的濃度呈正相關(guān)[17]。免疫活化的巨噬細胞在氧化酶(NOX2/gp91phox)和誘導型的iNOS 催化下產(chǎn)生的抗菌活性物ROS和RNS也能有效抵抗MTB感染[18]。MTB可以通過干擾巨噬細胞抗原提呈和避免反應氧和反應氮產(chǎn)物的毒性效應等多種途徑逃逸巨噬細胞的免疫殺傷。Sharma等[19]報道Groel1可通過影響低氧組織的基因表達從而保證結(jié)核桿菌在低氧下存活。同時有研究報道感染的鼠模型缺乏Groel1后不能產(chǎn)生炎癥反應[20]。

綜上所述，MTB Hsp60刺激小鼠骨髓巨噬細胞后CⅡTA、PⅣ、IL-27、PⅠ、PⅢ的 mRNA水平有不同變化，且受到MTB Hsp60濃度和時間的影響，提示MTB Hsp60可以影響小鼠骨髓巨噬細胞MHCⅡ類分子的表達。MHCⅡ類分子隨MTB Hsp60刺激濃度的增加而減少，而CD86升高，提示MTB Hsp60抑制小鼠骨髓巨噬細胞MHCⅡ類分子的表達。Hsp60蛋白可以抑制巨噬細胞抗原提呈功能從而逃避巨噬細胞的免疫殺傷，導致MTB感染，進而增加MTB在細胞內(nèi)存活、增殖，進一步導致MTB慢性感染和潛伏感染。本研究結(jié)果可為后續(xù)深入探討Hsp60蛋白對MTB 感染巨噬細胞的影響及結(jié)核潛伏感染機制提供重要的實驗和理論依據(jù)。在進一步實驗中，本課題組將繼續(xù)對結(jié)核感染和潛伏感染患者外周血的巨噬細胞進行相關(guān)研究。