非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的建立①

萬小雨 曾俊豪 張婉怡 韓钘雨 楊天心 王雅琴 周永芹 劉朝奇

(三峽大學腫瘤微環境與免疫治療湖北省重點實驗室，宜昌 443002)

非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD)是指除酒精和其他明確的損肝因素外所致的以肝細胞內脂肪過度沉積為主要特征的臨床病理綜合征，包括單純性脂肪肝炎(simple fatty liver，SFL)、非酒精性脂肪性肝炎 (nonalcoholic steatohepatitis,NASH)及相關肝硬化[1,2]。NASH是NAFLD疾病譜中的最重要組成之一，是NAFLD進展至肝硬化和肝細胞癌的重要環節[3,4]，因此建立動物模型探討NASH發生發展機制及尋找有效干預藥物尤為重要。目前高脂飲食所致NASH的動物模型多有報道，但造模周期平均為3～5個月，甚至長達1年，無法滿足藥物高通量和快速篩選的需求[5-7]。近年研究發現NAFLD發展機制的重要環節：腸肝軸，即腸道、肝臟和血液代謝之間的相互作用探討給予調控NAFLD的進程[8，9]。本實驗采用不同濃度葡聚糖硫酸鈉(dextransulfatesolin,DSS)對結腸造成不同程度的損傷，短期內成功再現NASH的動物病理模型。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 雄性昆明小鼠80只，4～6周齡，體質量(18±2)g，由三峽大學實驗中心提供，SPF級環境飼養。于恒溫(20±2)℃及濕度(50±2)%條件下，人工照明明暗各12 h，適應性喂養2 d后隨機分組。

1.1.2試劑 DSS購自上海翊圣生物科技有限公司，相對分子量為(36～50)×103；膽固醇購自國藥集團化學試劑有限公司；總RNA提取試劑盒和逆轉錄試劑盒購自大連寶生物科技有限公司；PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

1.1.3動物飼料 普通飼料由三峽大學實驗動物中心提供。高脂飼料配方為普通飼料53.5%、果糖20%、豬油20%、膽固醇5%、食鹽1%、膽酸鈉0.5%，混合固定成形，送至武漢農科院輻照滅菌備用[10]。營養成分見表1。

表1 高脂飼料營養成分表Tab.1 Table of high-fat diet nutrition composition

1.2方法

1.2.1動物飼養及分組 80只昆明小鼠隨機分為8組，每組10只，對照組給予普通飼料及正常飲水，2%DSS組、2.5%DSS組、3%DSS組給予普通飼料，HFD組、2%DSS+HFD組、2.5%DSS+HFD組、3%DSS+HFD組高脂飼料喂養。飼養1周后，飲水均換成相應濃度DSS溶液，連續自由攝入5 d，共觀察2周[11-13]。

1.2.2肝臟、結腸組織病理檢測及腸道組織學評分 肝臟、結腸組織按常規方法進行石蠟包埋、切片和HE 染色；取新鮮肝臟組織進行冰凍切片， 按試劑盒說明進行油紅O染色，光鏡下觀察。結腸組織學評分標準見表2，由2名實驗人員獨立閱片并評分，總評分為上皮細胞和炎癥細胞浸潤評分總和(總評分=E+I)。

表2 結腸組織學評分Tab.2 Colonic histology score

1.2.3RT-PCR檢測小鼠肝臟組織中碳水化合物反應元件結合蛋白(carbohydrate response element，binding protein，chREBF)、IL-6的表達 稱取凍存肝臟組織50 mg，用Trizol法提取組織總RNA，微量核酸儀測定RNA濃度，經逆轉錄試劑盒逆轉錄得到cDNA，逆轉錄體系按照試劑盒說明書操作，采用RT-PCR法檢測各組肝臟組織中脂質代謝相關基因chREBF以及炎癥相關基因IL-6的表達情況。RT-PCR所用引物列表見表3。

表3 引物序列Tab.3 Primer sequences

2 結果

2.1小鼠一般體征觀察 各組小鼠體質量變化見圖1 ，不同濃度DSS組與對照組相比，均呈下降趨勢，其中3%DSS組下降趨勢最顯著(P<0.05)；與相同濃度DSS組相比，聯合高脂組下降趨勢均較大，其中3%DSS+HFD組小鼠體質量下降趨勢最顯著(P<0.001)。給予DSS的第3天，DSS組小鼠出現不同程度的腹瀉、肛門紅腫、便血，試驗期間無小鼠死亡。

圖1 相同濃度DSS組小鼠體質量變化率Fig.1 Body weight change rate of mice in same concentra-tion of DSS groups

2.2結腸炎癥反應的大體觀察 分離整段結腸組織，肉眼可見對照組腸道無紅腫、形態正常，DSS各組可見腸道中含帶血的糞便，腸道呈鮮紅色；各組結腸組織長度差異見圖2，對照組結腸長度相對正常，3%DSS+HFD組結腸長度相對較短，相同濃度DSS組與對照組相比，2.5%DSS組結腸長度顯著縮短(P<0.001)；相同濃度DSS與對應聯合高脂組相比，3%DSS+HFD組結腸長度顯著縮短(P<0.001)；腸長度顯著縮短(P<0.001，vs 2%DSS+HFD)，結果顯示3%DSS結合高脂飲食對結腸長度有顯著縮短作用。

圖2 結腸長度統計圖及圖片Fig.2 Colon length statistics and pictures

2.3結腸組織病理變化及病理評分 結果如圖3，HE染色顯示，正常組小鼠結腸上皮結構、腺體完整，黏膜下組織無損傷，部分黏膜下層可見少量的炎癥細胞浸潤，HFD組與正常組相比，可見少量杯狀細胞丟失，炎性細胞圍繞隱窩浸潤，組織評分結果具有統計學意義(P<0.05)；與正常組相比，3種DSS濃度組均可見炎癥細胞浸潤、結腸壁增厚，固有腺體排列紊亂、變形，杯狀細胞大量流失，病理評分顯著升高(P<0.001)；相同濃度DSS與對應聯合高脂組比較，聯合高脂組炎癥更嚴重，其中2%DSS與2.5%DSS兩組病理評分均顯著升高(P<0.01)，提示DSS結合高脂飲食會進一步加重結腸炎的進展。

圖3 結腸HE染色結果及組織病理評分統計圖(×200)Fig.3 Colon HE staining results and histopathological score statistics (×200)

2.4肝臟組織病理學及脂質沉積的觀察 HE染色結果見圖4，正常肝組織肝索以中央靜脈為中心，呈放射狀排列，細胞形態清晰，高脂組中細胞腫脹，排列紊亂，可見脂質空泡；與對照組比較，單純DSS組均未見病理改變，聯合高脂組中3%DSS+HFD組脂肪變相對明顯，脂肪變性細胞明顯增多，圖片中可見大量脂質空泡，且炎癥細胞浸潤數量與DSS濃度呈正比；由圖5可見，油紅O染色3種濃度DSS組肝臟中均可見紅色脂滴形成，單純DSS組可見少許紅染脂滴，DSS聯合高脂組有密布大小不等脂滴及脂滴片狀融合，其中3%DSS濃度聯合組肝臟脂滴分布相對較多，結果提示2.5%和3%DSS濃度聯合高脂組均可建立明顯脂肪性肝炎模型。

圖4 肝臟HE染色結果(×200)Fig.4 Liver HE staining results (×200)

圖5 肝組織油紅O染色(×400)Fig.5 Liver tissue oil red O staining(×400)

2.5肝臟組織中chREBF、IL-6的表達水平 如圖6，與對照組相比，單純DSS組chREBP表達水平無統計學差異，IL-6表達水平顯著上調(P<0.01)。相同濃度DSS下單純DSS組與聯合高脂組相比較，聯合高脂組中chREBP表達水平均升高，其中DSS濃度為3%時兩組相比表達水平差異最大，具有統計學意義(P<0.05)； DSS濃度為2.5%時，高脂聯合組IL-6表達水平顯著升高(P<0.001)，但3%DSS聯合高脂組較單純DSS組IL-6表達水平顯著下調(P<0.01)，結合實驗期間本組小鼠的情況，表現為體質量顯著下降(P<0.001 vs對照組)，活動減少，精神萎靡，因此其炎癥反應未出現疊加效應。結果提示2.5%DSS+HFD組為建立非酒精性脂肪肝炎最優模型。

圖6 RT-PCR檢測基因chREBP、IL-6的表達情況Fig.6 Expression of chREBP，IL-6 mRNA by RT-PCR

3 討論

近年來，對NAFLD/NASH 動物模型的報道成為研究熱點，其對精確致病機制的進一步研究和積極尋找 NASH 的潛在治療藥物至關重要。從發病機制、病程的發生發展及最終組織形態學改變與人類組織的差異，及動物的死亡率、成本代價上來考慮，最常采用的動物模型為飲食誘導型，此種方法造模要使癥狀明顯，至少需要2個月以上，時間成本較高[14-17]。本實驗實驗周期為2周，相比文獻中所報道的，大大縮短了造模時間，并且再現了NASH肝臟的病理變化，即肝細胞脂肪病變和炎癥反應。

NASH的發病機制極為復雜，目前公認的經典學說為“二次打擊”學說[18]。“初次打擊”是指脂肪在肝臟中堆積，其重要的“第二次打擊”為脂肪堆積的肝臟發生慢性炎癥反應、肝細胞變性壞死甚至肝纖維化、肝硬化[19]。文章中肝臟油紅O染色單純DSS組可見紅色脂滴沉積，提示單純DSS組小鼠肝臟中有脂肪堆積，原因在于用DSS處理小鼠后，由于小鼠有高水平的硬脂酰溶血軟磷脂和低水平的油酰溶血卵磷脂導致了肝臟中的硬脂酰輔酶A去飽和酶(SCD-1)表達受到抑制，而SCD-1是調節飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸比例的酶，其下調導致了脂肪堆積，但此過程還尚未導致肝臟脂肪變化[20,21]。肝臟通過門靜脈系統接收腸道約70%的血液供應，通過門靜脈和膽管樹肝臟和腸道緊密相連[22]。在1998年Marshall等提出“腸肝軸”的概念：腸道黏膜屏障被破壞，腸道內大量的細菌和內毒素經由門靜脈系統移位進入肝臟，導致肝臟中庫普弗細胞活化釋放炎癥因子，進一步造成腸黏膜受損，各種細胞、炎癥介質相互作用、影響，構成了一個復雜的網絡[8]。近年來有研究者使用1%DSS喂養小鼠引起腸黏膜損傷后，加重了刀豆蛋白A(ConA)急性肝損傷的肝臟炎癥，使用益生菌灌劑一定程度上修復了腸黏膜屏障，相對減輕了肝損傷的炎癥程度，因此認為DSS+對照A 組小鼠肝損傷加重可歸咎于腸黏膜屏障破壞導致的腸道有害物質入血增多，加重了肝臟炎癥[23]。G?bele等[24]用高脂飼料飲食聯合1%DSS飲水處理小鼠12周，結合慢性結腸炎建立NASH小鼠模型，促炎基因表達分析顯示DSS+HFD組小鼠MCP-1和TNF-α mRNA表達增加，LPS水平升高且TLR4和TLR9在炎癥狀態下均升高，HE結果顯示高脂飼料聯合DSS給藥組脂肪變性評分顯著升高(P<0.001 vs HFD組)，因此得出結論DSS給藥加重了高脂飲食小鼠模型的肝臟炎癥。本實驗用高脂飼料聯合不同濃度DSS飲水處理小鼠，起始DSS濃度為2%，目的是在短時間內造成小鼠急性潰瘍性結腸炎，對肝臟進行二次打擊，從形態學分析2.5%DSS+HFD和3%DSS+HFD組均出現明顯的脂質沉積，但3%DSS+HFD組小鼠疾病表現更嚴重，有導致小鼠死亡的風險，因此本研究推薦2.5%DSS+HFD組為最優NASH模型。

理想的動物模型在NASH發病機制及防治的研究中起至關重要的作用，因此應該具有與人類病理特征相似、死亡率低、模型重復率好、造模時間短、造模成本低等優點。本實驗利用高脂飼料飲食聯合DSS飲水誘導小鼠NASH動物模型，并對其進行了組織形態學分析和分子水平研究。結果發現通過高脂飼料飲食聯合DSS飲水處理小鼠在2周內完全可以建立NASH模型，為 NASH 防治提供新的思路和藥物篩選的平臺。然而對于NASH進一步發展為肝纖維化甚至肝癌的病理學特征，還有待于進一步充實和完善。