滴鼻感染甲型流感病毒對BALB/c和C57BL/6J小鼠自發行為學的比較研究①

周艷琳 谷李銘 李康生 王革非

(新鄉醫學院三全學院病原生物學與免疫學教研室，新鄉 453003)

流感病毒主要通過呼吸道感染宿主呼吸系統，引起呼吸系統疾病[1，2]。在部分感染人群中會出現一定程度的中樞神經系統(central nervous system，CNS)組織病變和功能障礙，其中一個重要的并發癥是流感急性腦病(influenza acute encephalopathy，IAE)，流感病毒感染后，患者出現1～2 d的呼吸道癥狀，伴隨嚴重的神經癥狀，并快速發展為認知障礙、精神狀態改變，嚴重時引起神經后遺癥甚至死亡[3-5]。

曠場試驗也稱敞箱實驗，是評價小鼠自發活動行為和焦慮狀態的經典行為學方法，被廣泛應用于精神神經藥理學、神經行為學等的基礎研究，用于定量評價小鼠的自發活動、探索行為及焦慮、抑郁狀態[6，7]。小鼠體質量的變化可以反映流感病毒PR8滴鼻感染是否對小鼠食欲造成影響；運動總路程反應小鼠在曠場實驗中運動量的大小，運動量大表明其中樞神經系統興奮，反之，則表明出現一定程度的抑郁狀況；周邊區域是小鼠的偏愛區域，周邊區域的活動頻率可反映小鼠的趨避性。

有關呼吸道外周感染流感病毒對CNS調控的認知、學習、空間記憶等行為的實驗動物研究少有報道。因此，有必要建立流感病毒外周滴鼻感染的有效動物模型，進一步研究流感病毒呼吸道感染對患鼠空間記憶、學習認知、探索行為和抑郁情緒的影響。本研究以甲型流感病毒毒株H1N1 PR8分別感染C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠，采用曠場自發試驗檢測C57BL/6J和BALB/c小鼠在感染急性期內體質量變化情況及在曠場行為箱內的自發行為運動情況，研究哪種小鼠更適合做流感病毒感染的模型小鼠，為進一步探究流感病毒感染對CNS損傷的機制及伴隨的學習、記憶、抑郁焦慮等行為學影響奠定基礎。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物 C57BL/6J雄性小鼠，12周齡，體質量20～24 g，共20只；BALB/c雄性小鼠，12周齡，體質量24～28 g，共20只。小鼠均購于廣東省醫學實驗動物中心，先飼養1～2周以適應新環境。本研究遵循國家及實驗動物單位制定的有關實驗動物福利的規則和制度。

1.1.2試劑與儀器 TRIzol、M-MLV kit、SYBR Green SuperMix購自Invitrogen公司；IL-1β、TNF-α、CXCL10、BDNF、GAPDH引物購自QIAGEN公司；ABI7500熒光定量PCR儀購自ABI公司。

1.1.3流感病毒毒株 H1N1病毒株A/Puerto Rico/8/34(簡稱 PR8)，由廣東省汕頭大學醫學院微生物與免疫學教研室實驗室保存，病毒滴度為1.2×107pfu/ml。病毒實驗均在動物生物安全三級實驗室(ABSL-3)中進行。

1.1.4曠場實驗動物行為學分析系統 ZS-ZFT型曠場實驗動物行為學分析系統(北京眾實迪創生物科技有限公司)由硬件和軟件兩部分構成。硬件儀器主要由一個為20 cm×20 cm×30 cm的封閉箱子組成，箱子頂部中央安置攝像機，與記錄系統相連接，記錄小鼠在曠場中的運動情況，如總路程、中央區域運動路程、周邊區域運動路程等[7]。

1.2方法

1.2.1動物處理 將C57BL/6J和BALB/c小鼠分別隨機分為2組，即C57BL/6J小鼠H1N1 PR8感染組(簡稱PR8組)和C57BL/6J小鼠生理鹽水對照組(簡稱CON組)，BALB/c小鼠H1N1 PR8感染組(簡稱PR8組)和BALB/c小鼠生理鹽水對照組(簡稱CON組)，每組10只，做好標記。5%水合氯醛(0.004 ml/g)輕度麻醉后，滴鼻感染小鼠，50 μl/只，逐日觀察小鼠發病情況，記錄小鼠體質量變化。

1.2.2曠場自發試驗 每天上午9∶00～11∶00檢測小鼠在曠場行為箱行為運動情況，總時間5 min，連續檢測7 d。

1.2.3小鼠腦組織RNA的提取及反轉錄 在感染后的第7天處死小鼠，取腦組織，TRIzol法提取腦組織RNA，M-MLV kit反轉錄為cDNA，用于qPCR檢測。

1.2.4小鼠腦組織炎癥因子的qPCR檢測 使用SYBR Green qPCR SuperMix試劑盒，以GAPDH為內參對腦組織中的炎癥因子TNF-α、IL-1β、CXCL10(C-X-C motif Ligand 10)、BDNF(brain derived neurotrophic factor)進行轉錄水平檢測。qPCR反應體系為20 μl，操作步驟按照Invitrogen公司說明書進行。

2 結果

2.1小鼠體質量變化 圖1A為流感病毒PR8(1∶500)感染C57BL/6J小鼠后7 d內的體質量變化。結果顯示：C57BL/6J小鼠感染PR8后，小鼠體質量逐漸下降，在感染后的第3、4、5、6、7天，與對照組相比差異有統計學意義(P<0.001)，在第7天處死的當天，10只小鼠僅6只存活，生存率為60%；圖1B為流感病毒PR8(1∶100 000)感染BALB/c小鼠后7 d內的體質量變化。結果顯示：BALB/c小鼠感染PR8后，小鼠體質量逐漸下降；在感染后的第6、7天，與對照組差異具有統計學意義(P<0.001)；10只小鼠全部存活，生存率為100%。前期實驗數據表明，甲型流感病毒PR8 以1∶500稀釋度感染BALB/c小鼠，可引起小鼠全部死亡。后逐漸擴大稀釋倍數，最終甲型流感病毒PR8采用1∶100 000稀釋倍數感染BALB/c小鼠，小鼠可全部存活，便于后期實驗開展。提示流感病毒PR8感染后，兩種小鼠體質量均下降，但BALB/c小鼠比C57BL/6J小鼠對流感病毒PR8更敏感。

圖1 滴鼻感染PR8對兩種品系小鼠體質量的影響Fig.1 Effect on weight of two strains mice infected intranasally with PR8

2.2運動總路程 圖2A是C57BL/6J小鼠在曠場行為箱體中運動總路程，結果顯示：CON組C57BL/6J小鼠運動量逐日減少，從第4天開始增加，符合小鼠自發活動的總路程先強后弱后又恢復的時相特點，與嚙齒類動物在新環境中先探索后熟悉環境的特點相符，表明小鼠曠場行為學研究造模成功；PR8感染組C57BL/6J小鼠行走總路程逐日減少，差異無統計學意義(P>0.05)。圖2B是BALB/c小鼠在曠場行為箱體中運動總路程，結果顯示：PR8感染組BALB/c小鼠行走總路程逐日減少，并無恢復趨勢，且在感染后的第6天，與對照組相比，差異有統計學意義(P<0.05)，在感染后的第7天具有極顯著統計學意義(P<0.001)。提示PR8感染BALB/c與C57BL/6J均可引起小鼠自主活動能力減弱，但BALB/c小鼠在感染后的第6、7天更加明顯，證實流感病毒PR8對于BALB/c小鼠自主活動能力的影響更加顯著。

圖2 滴鼻感染病毒PR8后兩種品系小鼠在曠場實驗中的總運動路程Fig.2 Total distance movement of two strains mice infected intranasally with PR8 in open field test

2.3周邊區域運動路程 圖3是BALB/c小鼠在曠場自發試驗中周邊區域行走路程，結果顯示，在感染后的第7天，與對照組相比差異具有統計學意義(P<0.001)，雖然前6 d差異無統計學意義(P>0.05)，但PR8 treatment 統計學差異顯著(P<0.001)。提示流感病毒PR8感染BALB/c小鼠引起小鼠趨避性增強，抑郁性增強，且在感染的急性期即第7天最為顯著。

圖3 BALB/c小鼠在曠場實驗中的總周邊運動路程Fig.3 Distance movement of BALB/c mice in out ring in open field test

2.4平均運動速度 圖4是BALB/c小鼠在曠場自發試驗中一周內平均運動速度情況。與對照組相比，在感染的第6、第7天差異均有統計學意義(P<0.01)。表明流感病毒PR8感染BALB/c小鼠引起活動性減弱可能伴有小鼠肌肉酸痛無力等運動生理改變而影響運動情況。

圖4 滴鼻感染病毒PR8后BALB/c小鼠在曠場實驗中平均運動速度Fig.4 Average movement speed of BALB/c mice in open field test infected intranasally PR8

2.5滴鼻感染流感病毒刺激BALB/c小鼠CNS炎癥因子轉錄水平變化情況 滴鼻感染流感病毒PR8可引起BALB/c小鼠在感染后第7天伴隨腦組織促炎因子、趨化因子、腦源性神經營養因子轉錄水平上調(圖5)。其中促炎因子TNF-α轉錄水平上調程度最高(P<0.01)，IL-1β變化與對照組相比差異性不顯著；趨化因子中CXCL 10的轉錄水平顯著上調(P<0.05)；腦源性神經營養因子BDNF轉錄水平顯著上調(P<0.05)。表明滴鼻感染流感病毒PR8引起BALB/c小鼠CNS發生以促炎因子、趨化因子及腦源性神經營養因子過度釋放為主要特征的細胞因子風暴，引發神經系統功能紊亂，引起自發行為的降低，并伴隨焦慮、抑郁等情緒障礙。

圖5 BALB/c小鼠在CNS中炎癥因子的轉錄水平變化Fig.5 Transcript levels of inflammatory factors of BALB/c mice in CNS

3 討論

臨床中，流感病毒感染除引發呼吸道癥狀外，亦會對CNS造成多種類型的流感相關腦癥綜合征，主要表現為情緒障礙、學習認知下降、行為改變及自身免疫腦病等[3-5]。Jurgens等[8]發現流感病毒H1N1 PR8感染C57BL/6J小鼠在急性期可誘發神經炎癥、改變海馬神經元形態、損傷學習認知能力。課題組前期研究發現，流感病毒H1N1 WSN33外周滴鼻感染BALB/c小鼠，可引起小鼠在感染的急性期和恢復期自發行為改變，并伴隨抑郁、焦慮、緊張等情緒[7]。本研究對比非嗜神經性流感病毒H1N1 PR8滴鼻感染兩種近交系小鼠C57BL/6J小鼠和BALB/c小鼠對曠場自發行為的敏感性，結果表明滴鼻感染流感病毒PR8可引起小鼠在急性期體質量下降，肌肉酸痛活動性降低，伴隨明顯的抑郁焦慮情緒；BALB/c小鼠對流感病毒PR8的敏感度較C57BL/6J小鼠明顯，更適宜做流感病毒PR8感染的模型小鼠。此實驗中小鼠的周齡和性別需要保持一致，雌性小鼠有動情周期，激素水平可能會影響行為，因此本實驗全部采用雄性小鼠[9]。前期進行預實驗分別以1∶500、1∶5 000、1∶50 000稀釋流感病毒PR8原液，外周滴鼻感染BALB/c小鼠，發現其生存率分別為0、10%、50%，而甲型流感病毒PR8以1：500稀釋度感染C57BL/6J小鼠，小鼠的生存率為60%，BALB/c小鼠比C57BL/6J小鼠對流感病毒PR8更敏感。

小鼠自主活動行為的改變與小鼠CNS損傷相關，有研究表明，幼年時期抑郁焦慮情緒會誘發成年后空間記憶、學習認知等行為障礙[10]。本研究為進一步研究流感病毒PR8感染對小鼠空間記憶、學習認知、情緒等提供模型BALB/c小鼠，具有重要科學意義。目前較多學者認為流感病毒外周感染引起小鼠CNS損傷，可能與體內免疫分子的級聯反應導致的“因子風暴”有關，或與呼吸道或腸道微生物菌群環境變化打破菌群平衡有關[11-13]。本研究中患鼠不但伴有自發行為降低，抑郁、焦慮等情緒障礙，且CNS中促炎因子、趨化因子及腦源性神經營養因子在轉錄水平均出現不同程度的變化，表明流感病毒外周感染誘發的“細胞因子風暴”與中樞神經系統功能紊亂有關，但流感相關腦病的具體病理機制有待進一步的探究。這是否與流感病毒感染后呼吸道或腸道微生物菌群平衡打破存在相關性還有待明確，為進一步研究流感相關腦病的病理機制提供依據。