TRIM31過表達改善脂多糖誘導下神經細胞的炎癥損傷①

王 濤 梁日初 周 佳 羅 煒

(南華大學附屬第二醫院神經外科,衡陽 421001)

阿爾茲海默癥(Alzheimer′s disease,AD)和帕金森癥(Parkinson′s disease,PD)等神經退行性疾病嚴重威脅人類健康，其發病原因復雜，機制尚未完全明確。炎癥小體介導的炎癥途徑與中樞神經系統疾病的發生密切相關[1]。NOD樣受體蛋白3(nod-like receptor pyrin domain 3,NLRP3)炎癥小體是機體固有免疫應答的重要組成部分，其過度激活可通過活化caspase-1持續地將無活性的IL-1β前體剪切為成熟IL-1β，激活下游信號通路產生大量的炎癥因子，引起神經炎癥反應，促進細胞凋亡，導致大腦病變[2]。E3泛素連接酶31(TRIM31)是TRIM家族成員，可通過對特定靶分子進行泛素化修飾和降解，參與細胞增殖、分化、癌變、自噬、凋亡等多種細胞生物學過程[3]。目前關于TRIM31的研究較少且主要集中于癌癥研究，如胰腺癌、大腸癌、膽囊癌和肝癌等，關于其與神經退行性疾病的研究鮮有報道[4-7]。研究報道，TRIM31可通過促進NLRP3蛋白酶體泛素化降解，抑制NLRP3炎癥小體活化，推測TRIM31可能通過抑制NLRP3炎癥小體活化改善神經細胞炎癥損傷[8]。本研究擬采用LPS誘導PC12細胞建立體外神經細胞炎癥損傷模型，探討TRIM31對PC12細胞損傷的保護作用及機制，為神經退行性疾病治療提供新思路。

1 材料與方法

1.1材料 大鼠腎上腺嗜鉻細胞瘤PC12細胞株由上海中科院細胞庫提供；LPS購自美國Sigma公司；DMEM培養基和胎牛血清購自美國Gibco公司；TRIM31過表達質粒pcDNA3.1-TRIM31及其陰性對照質粒pcDNA3.1-NC均由漢恒生物科技(上海)有限公司構建；LipofectamineTM2000購自美國Invitrogen公司；反轉錄試劑盒、實時定量PCR試劑盒購自美國Thermo Fisher公司；IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18 ELISA試劑盒購自上海卡努生物科技有限公司；MTT檢測試劑盒、BCA試劑盒和Annexin V-FITC流式凋亡試劑盒購自上海碧云天生物技術有限公司；TRIM31、NLRP3、caspase-1、Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax和GAPDH抗體均購自美國Abcam公司。酶標儀、電泳儀購自美國Bio-Rad公司；流式細胞儀購自美國Backman公司。

1.2方法

1.2.1MTT檢測細胞增殖活性 取對數生長的PC12細胞以5×104個/ml接種于96孔板，每孔100 μl，培養過夜。分別采用0、50、125、250、500和1 000 μg/ml LPS處理細胞24 h，培養結束后每孔加入20 μl MTT溶液(5 mg/ml)，37℃孵育4 h，酶標儀測定各組490 nm處吸光度值，并計算存活率，選擇最佳細胞損傷濃度進行后續實驗。

1.2.2細胞轉染及分組處理 取對數生長期PC12細胞，胰酶消化制備單細胞懸液，2×105個/孔接種于6孔板，待細胞融合度達到80%時，按照LipofectamineTM2000轉染試劑說明書，將pcDNA3.1-TRIM31和pcDNA3.1-NC分別轉染至PC12細胞，另取不做任何質粒轉染的PC12細胞作為空白對照組(blank)，分別記為TRIM31組、NC組和blank組。轉染48 h后，qRT-PCR和Western blot檢測轉染后PC12細胞中TRIM31表達水平以驗證轉染效果。將細胞分為4組：①對照組(Control)：PC12細胞不經任何處理；②LPS組：PC12細胞經500 μg/ml LPS處理24 h；③LPS+NC組：轉染陰性對照質粒后的PC12細胞，再經500 μg/ml LPS處理24 h；④ LPS+TRIM31組：轉染TRIM31過表達質粒后的PC12細胞，再經500 μg/ml LPS處理24 h。

1.2.3ELISA檢測細胞上清中炎癥因子含量 收集各組細胞培養上清，5 000 r/min離心10 min，收集上清，按照試劑盒說明書操作，酶標儀檢測450 nm處各孔OD值，根據標準曲線計算IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量。

1.2.4流式細胞術檢測細胞凋亡 收集各組細胞，離心、洗滌后置于流式管，加入195 μl Annexin V結合液重懸細胞，再加入5 μl Annexin V 染液，振蕩混勻后于室溫下避光孵育15 min，加入10 μl PI染液，室溫下避光孵育10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.5免疫熒光檢測NLRP3蛋白表達 將轉染的PC12細胞以1×105個/孔接種于含無菌載玻片的6孔板，待細胞融合度達到70%時，加入500 μg/ml LPS處理24 h。棄細胞培養液，加入4%多聚甲醛室溫固定15 min，PBS洗3次后以2%BSA室溫封閉1 h，再加入50 μl NLRP3抗體稀釋液，4℃孵育過夜。次日，PBS洗滌并滴加Alexa Fluor?488標記的熒光二抗稀釋液，避光室溫孵育30 min，PBS洗滌加入DAPI室溫下染核5 min，PBS洗滌，載玻片上滴加適量抗熒光淬滅封片劑，置于熒光顯微鏡下觀察拍照。

1.2.6qRT-PCR檢測基因表達 收集各組細胞，Trizol法提取細胞總RNA，逆轉錄為cDNA，以cDNA為模板，GAPDH為內參，熒光PCR擴增儀擴增各基因mRNA，95℃ 30 s，95℃ 5 s，60℃ 30 s，共40個循環。2-ΔΔCt法計算TRIM31、NLRP3和caspase-1 mRNA相對表達水平，引物序列見表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequences

1.2.7Western blot檢測蛋白表達 收集最佳濃度處理后的PC12細胞和未經任何處理的PC12細胞沉淀，收集1.2.2各組細胞沉淀，分別加入適量RIPA裂解液于冰上裂解，12 000 r/min于4℃離心20 min，取上清，BCA試劑盒檢測蛋白濃度。取25 μg 蛋白經沸水浴變性后，10% SDS-PAGE分離蛋白并轉移至PVDF膜，5%脫脂牛奶室溫封閉1 h，加入一抗TRIM31、NLRP3、caspase-1、Cleaved-caspase-3、Bcl-2、Bax和GAPDH，4℃孵育過夜，TBST洗膜3次后加入辣根過氧化酶標記的山羊抗兔IgG二抗，室溫孵育1 h，加入ECL發光液，暗室顯影并拍照。Image J軟件對蛋白電泳條帶灰度值進行定量分析。

2 結果

2.1LPS對PC12細胞增殖活性的影響 MTT檢測結果顯示，隨LPS干預濃度提高，PC12細胞增殖活性逐漸降低(F=62.820，P<0.001)。50 μg/ml和125 μg/mlLPS處理對PC12細胞增殖活性差異無統計學意義(P>0.05)。250、500、1 000 μg/ml LPS處理PC12細胞時細胞增殖活性分別為(80.67±4.92)%、(66.01±3.27)%和(43.66±3.30)%，見圖1。根據MTT結果選擇500 μg/ml LPS作為后續實驗工作濃度。

圖1 不同濃度LPS對PC12細胞存活率的影響Fig.1 Effect of different concentrations of LPS on survival rate of PC12 cells

2.2LPS對PC12細胞TRIM31蛋白表達的影響 500 μg/ml LPS處理PC12細胞24 h后，PC12細胞TRIM31蛋白表達水平顯著降低(P<0.01)，見圖2。

圖2 LPS處理后PC12細胞TRIM31蛋白表達水平Fig.2 Protein expression levels of TRIM31 in PC12 cells after LPS treatment

2.3TRIM31過表達對PC12細胞TRIM31 mRNA和蛋白表達的影響 與blank組相比，NC組PC12細胞TRIM31 mRNA和蛋白表達水平差異無統計學意義(P>0.05)；與NC組相比，TRIM31組PC12細胞TRIM31 mRNA和蛋白表達水平顯著升高(P<0.01)，見圖3。

圖3 轉染后PC12細胞中TRIM31 mRNA和蛋白表達水平Fig.3 mRNA and protein expression levels of TRIM31 in infected PC12 cells

2.4TRIM31過表達對LPS誘導下PC12細胞炎癥因子水平的影響 與Control組相比，LPS組細胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18表達水平均顯著上升(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+TRIM31組細胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18表達水平均顯著下降(P<0.01)，與LPS+NC組差異無統計學意義(P>0.05)。見圖4。

圖4 各組細胞上清IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量Fig.4 Contents of IL-6,TNF-α,IL-1β and IL-18 in cell supernatant of each group

2.5TRIM31過表達對LPS誘導下PC12細胞凋亡的影響 與Control組相比，LPS組細胞凋亡率顯著上升(P<0.01)，細胞內Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平顯著上調(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平顯著下調(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+TRIM31組細胞凋亡率顯著下降(P<0.01)，細胞內Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平顯著下調(P<0.01)，Bcl-2蛋白水平顯著上調(P<0.05)，與LPS+NC組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖5、6。

圖5 各組細胞凋亡率Fig.5 Apoptosis rate of cells in each group

圖6 各組細胞Cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表達水平Fig.6 Expression levels of Cleaved-caspase-3,Bcl-2 and Bax proteins in each group

圖8 各組細胞NLRP3和caspase-1表達水平Fig.8 Expression levels of NLRP3 and caspase-1 in each group

2.6TRIM31過表達對LPS誘導下PC12細胞NLRP3炎癥小體活化的影響 與Control組相比，LPS組細胞NLRP3熒光強度顯著增強，細胞內NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表達水平均顯著增加(P<0.01)；與LPS組相比，LPS+TRIM31組細胞NLRP3熒光強度顯著減弱，細胞內NLRP3、caspase-1 mRNA和蛋白表達水平均顯著降低(P<0.01)，與LPS+NC組差異無統計學意義(P>0.05)，見圖7、8。

圖7 免疫熒光檢測各組細胞中NLRP3表達水平(×200)Fig.7 Expression level of NLRP3 of cells in each group detected by immunofluorescence (×200)

3 討論

神經系統退行性疾病呈進行性發展，且發病機制不明確，治愈率較低。近年研究已明確NLRP3作用，且在AD、PD等患者中均發現NLRP3炎癥小體的活化[9,10]。激活的NLRP3炎癥小體可促進關鍵致炎因子IL-1β等成熟和分泌，參與內在免疫炎癥反應，導致炎癥細胞凋亡。神經免疫炎癥是級聯反應，事件啟動后將產生大量神經免疫炎癥因子，尋找神經免疫炎癥的上游因子作為關鍵靶點，將為根源上遏制神經系統退行性疾病提供思路。TRIM31是TRIM家族Ⅴ亞族成員，但其相關研究報道較少，可能與炎癥和腫瘤相關，但具體作用機制尚不明確，且其在神經系統退行性疾病中的作用鮮有報道。在靜止和活化的巨噬細胞中，TRIM31可直接與NLRP3炎癥小體結合，介導其蛋白酶降解維持其低表達，抑制炎癥反應，提示TRIM31可能參與AD、PD等神經系統退行性疾病發展[8]。但TRIM31與NLRP3炎癥小體在AD和PD中的關系如何、TRIM31是否可通過調控NLRP3炎癥小體活化參與AD和PD病理進程等尚不明確。本研究結果顯示，LPS處理可抑制PC12細胞TRIM31蛋白表達，而過表達TRIM31可減少PC12細胞炎癥反應和細胞凋亡，其作用機制可能與抑制NLRP3炎癥小體活化相關。

PC12細胞來源于大鼠嗜鉻細胞瘤細胞，具備神經內分泌細胞的一般特征，廣泛用于神經生理和神經藥理學研究[11]。本研究采用LPS誘導PC12細胞建立體外神經細胞炎癥損傷模型，結果表明LPS劑量依賴性抑制PC12細胞增殖活性，LPS作用濃度為500 μg/ml時，PC12細胞存活率約為65%，與陳艷杰等[12]研究結果相似。500 μg/ml LPS作用PC12細胞24 h，細胞活力雖有所下降，但活性仍為65%，仍可保持細胞持續增殖狀態，符合細胞模型的一般要求，故本研究選取該濃度進行后續研究。

炎癥因子作為神經細胞應激活化后釋放的分子在AD和PD等神經炎癥中起核心作用。研究證實，AD和PD患者大腦黑質和紋狀體組織中存在異常表達的炎癥因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，與神經細胞的凋亡和神經損傷相關[13]。Miryam等[14]在AD和PD動物模型中發現，IL-1β、IL-6等炎癥因子在模型動物海馬組織中高表達。本研究結果顯示，LPS誘導下的PC12細胞內IL-6、TNF-α、IL-1β和IL-18含量顯著上升，細胞凋亡率和凋亡相關蛋白Cleaved-caspase-3、Bax蛋白水平顯著上調，Bcl-2蛋白水平顯著下調。轉染TRIM31過表達質粒后，PC12細胞炎癥因子、細胞凋亡率及Cleaved-caspase-3和Bax蛋白明顯下調，Bcl-2蛋白上調，提示TRIM31可能減少炎癥物質分泌，改善PC12細胞炎癥損傷，減少細胞凋亡。

NLRP3炎癥小體由NLRP3炎癥小體受體蛋白、ASC銜接蛋白和caspase-1構成，是炎癥因子成熟的重要途徑，在IL-1β、IL-18等炎癥因子釋放過程中發揮重要作用。NLRP3炎癥小體異常活化可導致包括神經退行性疾病在內的多種炎癥性疾病[15]。Heneka等[16]發現NLRP3炎癥小體激活可促進APP/PS1雙轉基因鼠腦內β-淀粉樣蛋白沉積和AD病理進程，NLRP3基因敲除小鼠可顯著緩解空間記憶障礙。Gordon等[17]發現PD模型小鼠大腦黑質IL-1β、caspase-1和NLRP3表達顯著上調，但經NLRP3抑制劑MCC950治療后，PD小鼠運動能力明顯改善，提示NLRP3可能是AD、PD等神經退行性疾病的潛在靶點。TRIM31可促進NLRP3蛋白酶體泛素化降解[8]。為進一步明確TRIM31與NLRP3炎癥小體在神經細胞炎癥損傷中的調控作用，本研究檢測各組細胞NLRP3和caspase-1表達水平，結果顯示LPS誘導PC12細胞后，細胞NLRP3和caspase-1表達顯著上調，說明NLRP3炎癥小體被激活。轉染TRIM31過表達質粒后，細胞NLRP3和caspase-1表達被顯著抑制，說明過表達TRIM31可能促進NLRP3蛋白酶體泛素化降解，抑制NLRP3炎癥小體活化，進而抑制LPS誘導的PC12細胞炎癥損傷。

綜上所述，過表達TRIM31可通過抑制NLRP3炎癥小體活化，減輕LPS誘導下PC12細胞內炎癥反應，減少細胞凋亡，緩解PC12細胞炎癥損傷，為AD和PD等神經系統退行性疾病的防治提供全新的藥物作用靶點。臨床應用該類藥物時可通過設計合成TRIM31小分子激動劑或尋找天然化合物作用于該靶點，并進行化學修飾、制劑改造、聯合用藥、超聲波干預等，促使其進入血腦屏障。