白花蛇舌草提取物通過Hippo-YAP信號通路抑制胰腺癌SW1990細胞上皮細胞間質轉化①

王自闖 張 娟 陳小永

(河南中醫藥大學第二臨床醫學院，鄭州 450002)

胰腺癌屬于惡性程度最高且預后最差的惡性腫瘤，目前臨床主要采用手術并輔以放化療等方法進行治療，但常規化療藥物治療效果不理想[1]。腫瘤細胞對化療藥物產生耐藥性導致化療失敗，因而仍需尋找安全有效的治療藥物[2，3]。濕毒、熱毒及濕熱毒邪互結是誘發胰腺癌的主要原因，研究表明白花蛇舌草具有清熱解毒與利水消腫等功效，并可抑制多種腫瘤細胞增殖[4]。另有研究顯示細胞上皮間質轉化(epithelial mesenchymal transition，EMT)與腫瘤侵襲轉移、耐藥性等生物學過程密切相關[5]。關于白花蛇舌草提取物對胰腺癌細胞EMT的影響及作用機制的研究相對較少，因此本研究主要探討白花蛇舌草提取物在胰腺癌中的生物學效應，初步分析其對Hippo-YAP信號通路的影響及與胰腺癌細胞EMT的關系，為臨床合理用藥提供分子生物學依據。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗細胞 人胰腺癌SW1990細胞購自中國科學院上海生命科學院細胞資源中心。

1.1.2主要試劑與儀器 白花蛇舌草購自本院中草藥房，依據中國藥典且經本院中醫科驗證；胰蛋白酶(批號170306)、胎牛血清(FBS)(批號170815)、RPMI1640培養基(批號170523)均購自美國BD公司；AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒(批號170205)購自碧云天生物有限公司；兔抗人Yes相關蛋白(Yes-associated protein，YAP)(批號170603)、磷酸化Yes相關蛋白(p-YAP)抗體(批號170701)均購自美國CST公司；CCK-8檢測試劑盒(批號171003)均購自美國ThermoFisher公司；Hippo-YAP信號通路抑制劑XMU-MP-1(批號170920)購自美國MCE公司；兔抗E鈣黏附蛋白(E-cadherin)(批號170711)、兔抗N-鈣黏附蛋白(N-cadherin)(批號170612)、兔抗波形蛋白(Vimentin)(批號170621)、鼠抗α平滑肌動蛋白(α-SMA)(批號170615)、兔抗轉錄因子(Snail)(批號170618)單克隆抗體均購自美國Cell Signal公司；辣根過氧化物酶標記IgG抗體(批號170912)購自美國Santa Cruz公司；ECL發光蛋白(批號170810)購自上海銳賽生物技術有限公司；RIPA裂解液(批號170422)、BCA檢測試劑盒(批號170418)、PVDF膜(批號170719)購自上海酶聯生物科技有限公司。流式細胞儀購自美國BD公司；蛋白凝膠成像儀購自Bio-Rad公司。冬凌草甲素(Oridonin，Ori)購自上海詩丹德生物技術有限公司，利用含有30%DMSO的滅菌水配制為5 mmol/L母液。

1.2方法

1.2.1細胞培養 胰腺癌SW1990細胞培養于含10%FBS的RPMI1640培養基中，加入鏈霉素(100 μg/ml)、青霉素(100 U/ml)，置于培養箱中培養(37℃、5%CO2)，每2 d傳代1次，穩定2～3代后，收集對數生長期細胞用于實驗。

1.2.2試驗處理與分組 白花蛇舌草研磨后過200目篩，選取50 g白花蛇舌草粉末，加入雙蒸水煎煮3次，1 000 r/min離心15 min，待上清液濃縮至50 ml(1.0 g/ml白花蛇舌草提取物)，(MTT法，48 h檢測細胞增殖抑制率)計算白花蛇舌草提取物的IC50值。根據IC50值將其終濃度分別稀釋為20 mg/ml、50 mg/ml、100 mg/ml白花蛇舌草提取物溶液備用。取對數期生長胰腺癌SW1990細胞，接種于培養板，繼續培養24 h后進行處理，試驗分為7組：①對照組：不添加任何藥物處理；②低劑量組：加入20 mg/ml的白花蛇舌草提取物共培養；③中劑量組：加入50 mg/ml的白花蛇舌草提取物共培養；④高劑量組：加入100 mg/ml的白花蛇舌草提取物共培養。4組細胞處理后均繼續培養48 h。⑤抑制劑組：在SW1990細胞中加入Hippo-YAP信號通路抑制劑XMU-MP-1；⑥高劑量+抑制劑組：將抑制劑XMU-MP-1預處理SW1990細胞30 min后加入高劑量的白花蛇舌草提取物；⑦陽性對照組：在SW1990細胞中加入SW1990細胞EMT抑制劑Ori 15 μmol/L。收集各組細胞，檢測各項指標。

1.2.3CCK-8法檢測細胞增殖 待細胞融合度達80%左右，取對數生長期SW1990細胞，胰蛋白酶消化，制備單細胞懸浮液(5×104個/ml)接種于96孔板，繼續培養24 h，分別在0、12、24、36、48、60、72 h加入CKK-8溶液(10 μl/孔)，避光培養2 h，收集細胞，應用全自動酶標儀檢測各孔在450 nm波長處細胞吸光度，計算不同濃度白花蛇舌草提取物對SW1990細胞增殖抑制率。細胞增殖抑制率(%)=(1-藥物處理組吸光度均值/對照組吸光度均值)×100%。每個濃度設置4個復孔，實驗重復3次。

1.2.4AnnexinV-FITC/PI法檢測細胞凋亡情況 各組SW1990細胞分別處理48 h，胰酶消化(0.25%)分別收集各組SW1990細胞，PBS清洗，2 000 r/min 離心5 min，細胞密度調整為1×106個/ml，嚴格按照AnnexinV-FITC/PI細胞凋亡雙染試劑盒說明書操作，應用流式細胞儀檢測SW1990細胞凋亡情況。每組設置4個復孔，實驗重復3次。

1.2.5Western blot檢測YAP、p-YAP、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表達情況 PBS清洗各組細胞，加入RIPA裂解液，14 000 r/min離心15 min，收集上清，測定蛋白濃度。取50 μg蛋白，冰上冷卻后8%聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝膠電泳分離蛋白，采用全濕式電轉膜法將目的蛋白移至PVDF膜，脫脂牛奶(5%)封閉1 h，分別加入YAP、p-YAP、E-cadherin、N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail一抗(1∶1 000)，4℃孵育過夜，次日加入二抗(1∶2 000)，室溫孵育2 h，ECL發光顯影反應，目的蛋白均以β-actin為內參基因，并采用Bandscan圖像分析系統檢測條帶灰度值，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內參條帶灰度值。

2 結果

2.1白花蛇舌草提取物IC50值 培養48 h后，本研究提取的白花蛇舌草提取物的IC50值為45.63 ng/ml，本研究選擇50 ng/ml白花蛇舌草提取物作為安全實驗劑量。見圖1。

圖1 白花蛇舌草提取物IC50值Fig.1 IC50 value of Hedyotis diffusa extract

2.2不同濃度白花蛇舌草提取物對SW1990細胞增殖的影響 與對照組相比，白花蛇舌草提取物不同劑量組SW1990細胞增殖抑制率顯著升高(P<0.05)，且高劑量組顯著高于中劑量組及低劑量組(P<0.05)，見圖2。因此，本研究將以高劑量組進行后續試驗。

圖2 不同濃度白花蛇舌草提取物對SW1990細胞增殖的影響Fig.2 Effect of different concentrations of Hedyotis diffusa extracts Proliferation of SW1990 cells

2.3白花蛇舌草提取物對SW1990細胞凋亡的影響 與對照組相比，抑制劑組SW1990細胞凋亡率顯著降低(P<0.05)，而高劑量組、陽性對照組與高劑量+抑制劑組SW1990細胞凋亡率顯著升高(P<0.05)，且高劑量組和陽性對照組顯著高于高劑量+抑制劑組(P<0.05)，見圖3、表1。

表1 各組細胞凋亡率比較Tab.1 Comparison of apoptosis rate of cells of each group

圖3 白花蛇舌草提取物對SW1990細胞凋亡的影響Fig.3 Effect of Hedyotis diffusa extracts on apoptosis of SW1990 cells

2.4SW1990細胞中Hippo-YAP信號通路相關蛋白表達情況 與對照組相比，抑制劑組SW1990細胞中YAP蛋白相對表達量顯著升高(P<0.05)，而高劑量組、陽性對照組及高劑量+抑制劑組均顯著降低(P<0.05)，且高劑量組、陽性對照組顯著低于高劑量+抑制劑組(P<0.05)；與對照組相比，抑制劑組SW1990細胞中p-YAP蛋白相對表達量顯著降低(P<0.05)，而高劑量組、陽性對照組及高劑量+抑制劑組均顯著升高(P<0.05)，且高劑量組、陽性對照組顯著高于高劑量+抑制劑組(P<0.05)，見圖4、表2。

圖4 細胞Hippo-YAP信號通路相關蛋白表達情況Fig.4 Expression of protein related to Hippo Yap signaling pathway in cells

表2 細胞Hippo-YAP信號通路相關蛋白表達情況Tab.2 Expression of protein related to Hippo-Yap signaling pathway in cells

2.5SW1990細胞中EMT相關蛋白表達情況 與對照組相比，抑制劑組SW1990細胞中E-cadherin蛋白表達量顯著降低(P<0.05)，而N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表達量均顯著升高(P<0.05)；高劑量組、陽性對照組及高劑量+抑制劑組SW1990細胞中E-cadherin蛋白表達量顯著升高(P<0.05)，且高劑量組、陽性對照組顯著高于高劑量+抑制劑組(P<0.05)，而N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表達量均顯著降低(P<0.05)，且高劑量組、陽性對照組顯著低于高劑量+抑制劑組(P<0.05)，詳見圖5、表3。

表3 各組SW1990細胞中EMT相關蛋白表達情況Tab.3 Expression of EMT related proteins in SW1990 cells of each group

圖5 各組SW1990細胞中EMT相關蛋白表達情況Fig.5 Expression of EMT related proteins in SW1990 cells of each group

3 討論

胰腺癌是一種起源于腺管上皮的導管腺癌，其早期臨床癥狀不明顯，絕大部分患者就診時已處于臨床晚期，且術后患者生存率極低[6]。研究表明胰腺癌發生過程涉及多個基因表達異常，但關于胰腺癌發病機制尚未完全闡明[7]。目前關于白花蛇舌草提取物與胰腺癌細胞EMT的相關研究相對較少，因此本研究旨在分析白花蛇舌草提取物對胰腺癌細胞EMT的作用及通過激活Hippo信號通路的可能機制。

白花蛇舌草可通過p38與ERK1/2 MAPK途徑并抑制基質金屬蛋白酶-9和細胞間黏附分子-1表達抑制轉移潛能進而誘導人乳腺癌MCF-7細胞凋亡[8]。白花蛇舌草提取物還可通過調控相關因子表達進而抑制結直腸癌、肝細胞癌增殖及遷移[9-11]。研究表明白花蛇舌草提取物可通過降低Notch信號通路相關蛋白表達進而抑制肝癌發生及發展[12]。本研究結果顯示白花蛇舌草提取物不同劑量組SW1990細胞增殖抑制率顯著高于對照組，且高劑量組顯著高于中劑量組、低劑量組，說明白花蛇舌草提取物可有效抑制胰腺癌細胞增殖，且呈劑量依賴效應。Hippo信號通路可有效抑制細胞生長，并可參與細胞增殖、凋亡等生物學過程，其核心組分包括MST1/2、LATS1/2、YAP、SAV1、MOB1，其中YAP是致癌基因而信號通路中其他幾個基因均為抑癌基因[13]。研究表明Hippo信號通路激活后下游效應因子YAP發生磷酸化反應，而p-YAP滯留于細胞質內并發生降解，進而不可進入細胞核發揮轉錄激活功能，Hippo信號通路抑制后，YAP可進入細胞核，其通過與TEADs等多種轉錄因子相互作用并調控下游基因表達進而促進腫瘤增殖、遷移及侵襲[14]。已有研究顯示，Ori可抑制SW1990細胞發生EMT，抑制細胞增殖、遷移與侵襲[15]。本研究以其為陽性對照，通過抑制Hippo信號通路分析其與白花蛇舌草提取物對胰腺癌細胞的作用，結果顯示抑制劑組SW1990細胞凋亡率顯著低于對照組，而高劑量組、陽性對照組及高劑量+抑制劑組顯著升高，且高劑量組、陽性對照組顯著高于高劑量+抑制劑組，與文獻報道相似[16]。提示白花蛇舌草提取物可促使胰腺癌細胞凋亡。同時本研究分析Hippo信號通路相關蛋白表達，結果顯示抑制劑組SW1990細胞中YAP蛋白相對表達量顯著高于對照組，而高劑量組、陽性對照組及高劑量+抑制劑組均顯著降低，且高劑量組和陽性對照組顯著低于高劑量+抑制劑組；而抑制劑組SW1990細胞中p-YAP蛋白表達量顯著降低，高劑量組、陽性對照組及高劑量+抑制劑組均顯著升高，且高劑量組、陽性對照組顯著高于高劑量+抑制劑組，高劑量組、陽性對照組無顯著差異，說明白花蛇舌草提取物處理后胰腺癌細胞中p-YAP蛋白表達升高，提示白花蛇舌草提取物可抑制胰腺癌SW1990細胞增殖并促進其凋亡，其可能通過激活Hippo-YAP信號通路發揮作用。

EMT表型轉換主要是上皮細胞向間質細胞轉變導致其轉移及侵襲能力增加，若上皮分子標記如E-cadherin表達下調而間質分子標記如N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail等表達上調即為促進EMT過程，反之則為抑制EMT發生[17]。研究表明EMT可促進胰腺癌細胞遷移及侵襲，通過抑制腫瘤細胞EMT可抑制其增殖及遷移并促使其凋亡[18，19]。相關研究顯示Hippo-YAP信號通路被抑制后，YAP表達水平上調并可促進EMT過程進而抑制腫瘤細胞凋亡[20]。本研究結果顯示抑制劑組SW1990細胞中E-cadherin表達量顯著低于對照組，而N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail表達量均顯著升高；高劑量組、陽性對照組及高劑量+抑制劑組E-cadherin蛋白表達量顯著升高，且高劑量組和陽性對照組顯著高于高劑量+抑制劑組，而N-cadherin、Vimentin、α-SMA、Snail蛋白表達量均顯著降低，且高劑量組和陽性對照組顯著低于高劑量+抑制劑組，說明抑制Hippo-YAP信號通路可促進胰腺癌SW1990細胞發生EMT，白花蛇舌草提取物處理后可抑制胰腺癌SW1990細胞EMT的發生，其可能與Hippo-YAP信號通路激活有關。提示白花蛇舌草提取物可能通過激活Hippo-YAP信號通路進而抑制胰腺癌SW1990細胞EMT。

綜上所述，白花蛇舌草提取物可抑制胰腺癌SW1990細胞EMT，其可能通過Hippo-YAP信號通路實現，為臨床白花蛇舌草提取物治療胰腺癌的分子機制提供理論依據。本研究存在一定不足，關于白花蛇舌草提取物治療胰腺癌過程中其他相關信號通路及其可能作用機制有待深入研究。