蛋氨酸腦啡肽聯合紫杉醇對肺癌細胞A549增殖和凋亡的影響

陳 灝 呼芳竹 鄧煜瑤 王曉楠 單風平

(中國醫科大學基礎醫學院,沈陽 110122)

全球癌癥的發病率和死亡率迅速上升，使癌癥成為大多數地區的主要死因。而其中，肺癌是最常診斷的癌癥，也是全球癌癥死亡的主要原因。根據最新統計，肺癌占新發癌癥總數的11.6%，占癌癥總死亡人數的18.4%，發病率和死亡率均排名第一[1，2]。約85%的肺癌患者是非小細胞型肺癌(non-small cell lung cancer,NSCLC)，腺癌和鱗狀細胞癌是其最常見的亞型。臨床上，超過60%的肺癌患者在診斷時出現局部晚期或轉移性疾病，手術切除不再是最佳選擇，此時肺癌患者的主要治療方法是常規化學療法和放射療法[3]。紫杉醇(paclitaxel，PTX)是一種用于治療癌癥的有效藥物，廣泛應用于NSCLC的臨床治療。但是，PTX也具有嚴重的副作用，包括嘔吐、腹瀉和骨髓抑制[4]。近年來，藥物聯合用是降低細胞毒性并且提高療效的有效方法。因此，研究新型抗腫瘤藥物與傳統化療藥物的聯合應用方案，對于肺癌治療具有十分重要的意義。

蛋氨酸腦啡肽(methionine enkephalin，MENK)是衍生自腎上腺素原激素腦啡肽的內源性阿片樣五肽，具有Try-Gly-Gly-Phe-Met氨基酸序列，也稱為阿片生長因子。MENK不僅具有神經內分泌和免疫調節活性，而且在與阿片受體結合后也具有直接的抗腫瘤活性[5]。根據既往研究報道，MENK可抑制胃癌、胰腺癌、卵巢癌、黑色素瘤、肝細胞癌和三陰性乳腺癌細胞生長[6]。前期實驗結果顯示，MENK對肺癌A549細胞的增殖具有抑制作用。因此，本文以肺癌A549細胞為研究對象，旨在探討MENK聯合PTX對肺癌A549細胞增殖和凋亡的影響。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1細胞 肺癌A549細胞由我院實驗室傳代保存，用含有10%胎牛血清和1%的青霉素、鏈霉素雙抗的RPMI1640培養基，置于37℃、5%CO2孵箱中傳代培養。

1.1.2藥物與試劑 MENK購于美國Penta Biotech公司；PTX購于北京索萊寶科技有限公司；RPMI1640培養基購于美國HyClone公司；CCK-8試劑盒、青霉素鏈霉素雙抗、0.25%胰酶均購于北京鼎國昌盛生物技術有限公司；標準胎牛血清購于天津市灝洋生物制品公司；Hoechst33258試劑盒購于上海碧云天生物技術有限公司；Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購于南京諾唯贊生物技術有限公司。

1.2方法

1.2.1CCK-8法檢測細胞增殖 取處于對數生長期的細胞，輕輕吹打混勻制成單細胞懸液，計數后按照5×103個/孔接種于96孔板，每孔加入200 μl培養基。24 h后各組吸去培養基，分別加入相應的藥物。單藥組每孔加入200 μl MENK或200 μl PTX；聯合用藥組MENK和PTX藥物濃度均濃縮1倍后，每孔分別加入100 μl藥物，使得終濃度與單藥組相同。具體分組為：MENK組(2 mg/ml、6 mg/ml、10 mg/ml)，PTX組(2 ng/ml、6 ng/ml、10 ng/ml),MENK聯合PTX組(2 mg/ml+2 ng/ml、6 mg/ml+6 ng/ml、10 mg/ml+10 ng/ml)。實驗設置空白對照組，加入200 μl RPMI1640培養基，每個濃度設置3個復孔。培養24 h，48 h后，加入CCK-8試劑，按照10∶1加入CCK-8試劑，以換液的形式加入。放入孵箱繼續培養2 h后，在酶標儀上用450 nm的波長測出各組OD值，實驗重復3次。

1.2.2藥物聯合應用效應評價 每個實驗組設置5個不同的濃度，分別為MENK組(2 mg/ml、4 mg/ml、6 mg/ml、8 mg/ml、10 mg/ml)，PTX組(2 ng/ml、4 ng/ml、6 ng/ml、8 ng/ml、10 ng/ml)，MENK聯合PTX組(2 mg/ml+2 ng/ml、4 mg/ml+4 ng/ml、6 mg/ml+6 ng/ml、8 mg/ml+8 ng/ml、10 mg/ml+10 ng/ml)，空白對照組加入RPMI1640培養基，細胞加入藥物作用48 h后，通過CCK-8法檢測各組抑制率，應用中效原理評價藥物間的相互作用[7，8]。

計算公式：藥物作用效應fa=1-實驗組平均OD值/對照組平均OD值。先將中效方程fa/fu=(D/Dm)m(fa 為藥物作用效應，即抑制率;fu=1-fa,D為藥物濃度，Dm為中效濃度，m 為斜率)兩邊取對數，得到對數方程log(fa/fu)=mlogD-mlogDm。設a=-mlogDm，b=m，x=logD，y=logfa/fu，代入后得到線性方程式y=bx+a。根據實驗所得fa和D值進行線性回歸分析，計算出單用及兩藥聯合應用時在各種效應所需藥物的濃度D=Dm(fa/fu)1/m，最后計算兩藥聯合應用在各種效應時的合用指數CI=D1/DX1+D2/DX2+α(D1D2)/(DX1DX2)。D1、D2是兩藥聯合應用時產生X效應的兩藥各自所需濃度，DX1、DX2是兩藥單獨使用時產生X效應的兩藥各自濃度。α=0為兩種相互排斥性藥物，α=1為兩種相互非排斥性藥物。由于MENK與PTX的作用機制不同，故本實驗中α=0。CI<1表示兩藥合用為協同效應，CI=1表示兩藥合用為相加效應，CI>1表示兩藥合用為拮抗效應。

1.2.3Hoechst33258法觀察細胞凋亡形態 取處于對數生長期的細胞，按照2×104個/孔接種于24孔板中，放入孵箱培養。24 h后吸去培養基，加入相應的藥物，各組濃度分別為MENK組(6 mg/ml)，PTX組(6 ng/ml)，MENK聯合PTX組(6 mg/ml+6 ng/ml)，空白對照組加入RPMI1640培養基，繼續放入孵箱培養。48 h后吸去培養基，加入0.5 ml固定液，在4℃條件下固定15 min。然后吸去固定液，用PBS洗滌2遍，每次3 min，再加入0.5 ml Hoechst33258染色液，室溫條件下避光染色10 min。最后用PBS洗滌2遍后避光風干，加入抗熒光淬滅封片劑封片，于倒置熒光顯微鏡下觀察細胞核形態并拍照。每組選取3個顯微鏡視野計算細胞凋亡個數，并計算細胞凋亡率。

1.2.4流式細胞術Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡 取處于對數生長期的細胞，接種于6孔板中，2×105個/孔。培養24 h后吸去培養基，加入相應的藥物，分別為MENK組(6 mg/ml)，PTX組(6 ng/ml)，MENK聯合PTX組(6 mg/ml+6 ng/ml)，空白對照組加入RPMI1640培養基，繼續放入孵箱培養。48 h后吸去培養基，用不含EDTA的胰酶消化并收集細胞。之后用預冷的PBS清洗離心2次，每組用100 μl的Binding Buffer重懸。分別加入5 μl的Annexin V-FITC和5 μl PI試劑，輕輕混勻后，室溫避光孵育15 min。最后加入400 μl Binding Buffer至每管，細胞經300目尼龍網過濾后，在流式細胞儀上進行檢測。

2 結果

2.1藥物單用及兩藥聯合應用對A549細胞增殖的抑制作用 CCK-8實驗結果顯示，作用24 h時，與對照組相比，MENK組(6 mg/ml、10 mg/ml)、PTX組(6 ng/ml、10 ng/ml)、MENK聯合PTX組(6 mg/ml+6 ng/ml、10 mg/ml+10 ng/ml)對細胞增殖的抑制效果更為明顯，差異具有統計學意義；與單藥組相比，MENK聯合PTX組抑制細胞增殖的效果略強，但是沒有統計學意義。作用48 h時，與對照組相比，除2 ng/ml PTX組外，其余各實驗組對細胞增殖的抑制效果都比較明顯，差異具有統計學意義；與單藥組相比，MENK聯合PTX組(6 mg/ml+6 ng/ml、10 mg/ml+10 ng/ml)抑制細胞增殖的效果更明顯，且差異具有統計學意義。在加入相應的藥物后，各實驗組對細胞增殖均表現出不同程度的抑制作用，并且隨著藥物作用時間的延長和藥物作用濃度的增加，其抑制效果也越來越明顯。見圖1。

圖1 單藥組及聯合用藥組對A549細胞增殖的抑制作用Fig.1 Inhibition of proliferation of A549 cells by single drug group and combination drug group

2.2MENK聯合PTX應用效應的評價 通過CCK-8實驗測出各個實驗組加入藥物作用48 h后的抑制率，繪制劑量-效應曲線。按照中效方程，計算不同fa下的CI，并繪制fa-CI曲線(圖2)。MENK與PTX聯合使用對于A549細胞增殖的抑制作用，在整個效應范圍中CI<1，說明兩藥聯合應用在整個濃度區間均產生協同效應。

圖2 MENK與PTX聯合應用48 h的劑量-效應曲線、fa-CI曲線Fig.2 Combination of MENK and PTX for 48 h dose-effect curve,fa-CI curve

2.3Hoechst33258染色法觀察各組細胞凋亡形態及凋亡率 Hoechst33258是一種可以透過細胞膜的藍色熒光染料，染色后，空白對照組的細胞呈均勻的淡藍色，形狀為圓形或橢圓形，比較規則。而MENK組，PTX組，MENK聯合PTX組的細胞呈現亮藍色，細胞核固縮、濃染、形狀不規則。根據熒光顯微鏡下計數，空白對照組的凋亡率為0.8%，而MENK組、PTX組、MENK 聯合PTX組的凋亡率分別為14%、21%、34%，各給藥組的細胞凋亡率均顯著升高。與單藥組相比，MENK聯合PTX組的細胞凋亡數量最多，差異具有統計學意義。見圖3。

圖3 熒光顯微鏡觀察各組細胞凋亡形態及凋亡率Fig.3 Fluorescence microscopy observation of apoptosis morphology and apoptosis rate of each group

2.4流式細胞術Annexin V/PI雙染色法檢測細胞凋亡 細胞加入相應的藥物作用48 h后，經流式細胞儀檢測，空白對照組的細胞凋亡率為1.53%，而MENK 組、PTX組、MENK聯合PTX組的細胞凋亡率分別為6.23%、6.04%、13.22%。與空白對照組相比，各加藥組的細胞凋亡率均明顯升高，并且MENK聯合PTX組細胞凋亡率高于單獨用藥組。結果表明，MENK、PTX均能誘導細胞凋亡，而兩者聯合應用后誘導細胞凋亡的作用更強。見圖4。

圖4 流式細胞術檢測各組細胞凋亡率Fig.4 Flow cytometry was used to detect apoptosis rate of each group

3 討論

肺癌作為一種嚴重危害人類健康的惡性疾病，具有增殖周期短，轉移活性強，死亡率高的特點。目前臨床上針對肺癌的主要治療手段是手術切除、化療和放療[9]。然而，手術切除僅適用于被診斷為早期肺癌并且癌細胞尚未轉移到附近淋巴結外的患者，化療在肺癌的綜合治療中仍然占據著十分重要的地位。PTX是肺癌化療的首選藥物，并廣泛用于治療多種癌癥，如乳腺癌、卵巢癌、黑色素瘤[10]。它通過結合微管蛋白和穩定非功能性微管束來阻斷正常的有絲分裂紡錘體發育和隨后的細胞分裂，從而表現出抗腫瘤活性[11]。另一方面，PTX自身的缺點也限制了其應用。一個是水溶性差，傳統上需要Cremophor EL或Polysorbate 80等載體進行靜脈輸送，而這些溶劑可能導致神經毒性和超敏反應；第二個缺點是紫杉醇具有多藥耐藥性，細胞抗性的發生限制了其功效和應用。多藥耐藥性是暴露于一種抗癌藥物的癌細胞顯示出對各種其他抗癌藥物的抗性的機制。通過激活跨細胞蛋白從細胞中排出化學物質，激活解毒系統的酶或改變基因控制細胞凋亡來實現多藥耐藥性。

MENK最初由Hughes于1975年發現，是一種內源性阿片類藥物，可調節先天性和適應性免疫系統，控制樹突狀細胞、巨噬細胞、CD4+T細胞、上皮細胞和間充質細胞的活化和調節功能[12]。不僅具有神經內分泌和免疫調節活性，而且在與阿片受體結合后也具有直接的抗腫瘤活性[5]。此外，MENK還在細胞發育、細胞更新、傷口愈合、血管生成、腫瘤發生和腫瘤進展中起作用。近年來的報道顯示，MENK以劑量依賴性方式，可以調節癌癥患者的免疫功能并通過結合阿片受體的方式來抑制腫瘤生長[13]。本研究團隊之前發表的文章表明，MENK可以加強DC和CD4+T細胞之間的通路，通過激活CD8+T細胞，抑制調節性T細胞(Tregs)，在腫瘤微環境中將M2型巨噬細胞轉變為M1型并誘導DC成熟，從而增強特殊細胞毒性以殺死腫瘤細胞。此外，頭頸部小細胞癌、胰腺腺瘤和結腸腺瘤的腫瘤移植研究也表明，當MENK與PTX、順鉑或吉西他濱聯合使用時，給予MENK可通過抑制細胞增殖阻止腫瘤生長，并降低毒性[14]。表明MENK可以作為細胞增殖的調節劑，影響在致瘤狀態中表達的免疫因子。

本研究結果顯示，MENK與PTX單獨使用以及聯合應用24 h、48 h后對A549細胞的增殖有不同程度的抑制作用，并且聯合用藥組的抑制效果要強于單獨用藥組。從實驗數據可以看出，無論是單獨用藥組，還是MENK聯合PTX組，隨著時間的延長和濃度的增加，其對細胞增殖的抑制率均有所增加，但是否具有時間依賴性和濃度依賴性還需要增加濃度梯度和時間點做進一步的研究。為明確兩藥之間是否具有協同作用，設置了5個不同的濃度梯度，并通過CCK-8法測出每個濃度所對應的藥物效應。通過中效原理計算分析發現，兩藥聯用指數(CI)在濃度范圍內均<1，兩藥間作用為協同效應。熒光染色實驗和流式細胞術結果表明，MENK和PTX均能誘導細胞凋亡，并且聯合用藥組的細胞凋亡率高于單獨用藥組。由此說明，MENK可以通過誘導細胞凋亡，從而抑制細胞增殖；與PTX合用后，能進一步加強對細胞的抑制作用，不過具體機制還有待研究。

綜上所述，肺癌是癌癥相關死亡的主要原因，化療期間的耐藥性是其治療中的主要障礙[15]。另外，由化療藥物所帶來的毒副作用也是臨床治療肺癌的不利因素。因此，探索藥物聯合應用方案，發揮藥物之間的協同潛力，可以提高肺癌化療的有效性，并且降低毒性。MENK作為一種潛在的新型抗腫瘤藥物，與PTX聯合應用，可以增強抗腫瘤活性，抑制腫瘤細胞的增殖，降低PTX的劑量，減輕它所帶來的毒副作用，為臨床化療用藥提供了一個新的思路。