IL-6磁微粒化學發光定量檢測方法的建立和評價

劉 珂 李雙法 李 奎 于 林 程云龍

(鄭州安圖生物工程股份有限公司，鄭州 450016)

IL-6是機體細胞因子網絡中的重要成員，屬于先天性免疫系統細胞因子，主要由淋巴細胞產生，在機體各組織普遍表達，在健康人血清中的含量極低[1]。IL-6最早于1980年被發現，分子量為22～27 kD，其前體肽有212個氨基酸，其中1～28位氨基酸是其前導肽，成熟肽由184個氨基酸組成[2]。作為當前所發現的功能最廣泛的細胞因子之一，IL-6生物效能復雜，能夠作用于多種效應細胞，在機體的造血調控和免疫應答等方面發揮重要作用。IL-6 的失調可能導致許多疾病的發生，例如腫瘤、慢性炎癥(如類風濕關節炎)、膿毒癥等，其臨床表現為發病時 IL-6 水平增高[3]。另外，手術患者的IL-6濃度可以預示手術并發癥產生的可能[4，5]；連續監測重癥監護患者IL-6的水平能夠有效評估系統性炎癥反應綜合征的嚴重程度，膿毒血癥以及膿毒血癥性休克的預后情況[6，7]；IL-6還能作為膿毒血癥的早期警告指標[8，9]。目前，IL-6檢測已在臨床實驗室廣泛開展，其檢測方法主要有生物學檢測方法和免疫學檢測方法。免疫學方法檢測作為臨床常用的檢測方法，已有相關商品化試劑盒供應，如電化學或化學發光法 IL-6 免疫分析試劑盒等。但是目前醫院所用大多為進口試劑盒，儀器、試劑和耗材價格昂貴，儀器維護成本高。隨著國內全自動磁微粒化學發光技術的提高及國產試劑盒質量的改善，自主開發IL-6檢測試劑盒十分必要。在市場上占有率最高的羅氏公司IL-6試劑盒采用電化學發光原理，三聯吡啶釕標記的抗原抗體復合物，在三丙胺的作用下發生氧化還原反應發出可見光，其相對光強度RLU與待測IL-6抗原濃度成正比。本研究利用國產全自動化學發光免疫分析儀，采用辣根過氧化酶(HRP)標記在IL-6抗體上，固相抗體、IL-6抗原與HRP標記的抗體在發光底物魯米喏的作用下，持續發出可見光，RLU與待測IL-6抗原濃度也成正比例關系，在此原理下基于CLIA建立IL-6水平檢測方法，對其進行條件優化及性能評估。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1血清標本 收集2019年1～7月于鄭州市中心醫院就診的發熱、肺炎等患者血清300例；正常人標本200例取自體檢科。

1.1.2試劑與儀器 鄭州安圖生物工程股份有限公司生產的全自動化學發光測定儀 AutoLumo A2000 plus；羅氏 e601及配套IL-6電化學發光檢測試劑盒；抗IL-6小鼠單克隆抗體(鄭州伊美諾生物技術有限公司)；IL-6國際標準品(英國國家生物標準與檢定，NIBSC，89/548)。

1.2方法

1.2.1包被抗體的制備 取磁珠包被緩沖液300 μl，加入300 μg的磁珠原液反復吹打，置于磁珠分離器上吸取上清后，添加碳二亞胺活化液，室溫反應30～60 min，然后加入鼠抗人IL-6捕獲抗體偶聯2 h或過夜，偶聯結束后，置于磁珠分離器上吸取上清，加入乙醇胺溶液進行封閉30 min，吸取上清后加入封閉液，混勻后置于磁珠分離器，棄上清，重復3～5次后，加入封閉液定容至3 ml，置于2～8℃保存。

1.2.2辣根過氧化物酶標記IL-6抗體的制備 采用過碘酸鈉法標記IL-6抗體并用半飽和硫酸銨法純化并透析，取上清加入50%甘油于-20℃保存。

1.2.3條件優化 包被磁珠保護液緩沖、包被抗體濃度、酶標記抗體濃度等條件均需優化，本文采用高值和低值混合血清標本來優化以上條件。

1.2.3.1共比較3種緩沖體系： ① 0.02 mol/L PBS(pH7.2)；② 0.05 mol/L Tris-HCl(pH7.2)；③ 0.05 mol/L MES(pH5.5)，以檢測信號值和與羅氏濃度相關性為主要考核目標。

1.2.3.2考核包被抗體濃度 以信號值為主要標準，選擇三個梯度：10 μg/ml、25 μg/ml、50 μg/ml，比較其高中低值標本的信號值大小。

1.2.3.3選擇最優酶標記抗體濃度 設置不同的梯度：0.6 μg/ml、0.4 μg/ml、0.2 μg/ml、0.1 μg/ml、0.05 μg/ml，考核其信號值大小。

1.2.4IL-6標準品配制 將 IL-6國際標準品用體系緩沖液(0.01 mol/l PBS、10 g/l BSA) 稀釋配制成不同濃度的校準品溶液S0～S5，濃度分別是0、5、50、200、500、1 000 pg/ml，分裝保存于-20℃。

1.2.5分析性能評估

1.2.5.1靈敏度 按照 CLSI EP17-A 文件[10]進行靈敏度的考核。準備5份接近0值的臨床標本，每個標本重復3次，連續檢測4 d；準備5份濃度范圍在LoB的1～4倍之間的標本，每天各檢測4次，間隔不小于2 h，每個指標2個重復，共進行5 d；按照EP17-A2的方法進行結果分析，計算LoB、LoD、FS。

1.2.5.2精密度 檢測高、中、低值混合均勻的IL-6水平血清標本，不同濃度標本每天各檢測2次，每次2個重復，間隔不小于2 h，連續測定20 d，分別計算各標本分析內精密度、分析間精密度及總不精密度。

1.2.5.3線性范圍 根據EP06-A文件進行線性范圍的建立。具體方法如下：準備10份濃度約為1 300 pg/ml的臨床高值標本和1份濃度接近于0的臨床低值標本，按照不同比例混合，制備出10組系列濃度的標本，作為線性標本進行測定，計算線性范圍。

1.2.5.4最大稀釋倍數 選擇線性范圍內的高值血清，用校準品稀釋液按2、4、8、16、32倍比稀釋，每個稀釋倍數連續測定3次，取其平均值作為實驗的測定結果，計算偏差。偏差=(實測值-預測值)/預測值×100%。

1.2.5.5準確度 根據EP09文件進行試劑盒的回收率評估。具體方法如下：選擇高值標本10份，按照1∶9的比例分別加入到10份低值標本/基質標本中，制成回收標本，每個回收標本重復檢測3次求均值，計算回收率。回收率r=[ C×(V0+VS)-C0×V0]/(CS×VS)×100% (V0：低值標本的體積，VS：高值標本的體積，C：回收標本的檢測濃度，C0：低值標本的檢測濃度，CS：高值標本的檢測濃度)。

1.2.5.6干擾實驗 取 IL-6濃度高、低值血清待測標本，分別加入不同濃度的血紅蛋白、三酰甘油、 膽紅素作為干擾標本，同時添加相同體積的體系緩沖液作為基礎標本，用本方法測定濃度值。計算干擾率。干擾率=(分析樣品的測定濃度-基礎樣品的測定濃度)/基礎樣品的測定濃度×100%。

1.2.5.7方法學比對 根據EP09-A2文件，分別用本文方法和羅氏檢測系統平行檢測。

1.3統計學處理 線性擬合采用Excel軟件進行，性能評價按照EP文件的實驗要求，實驗結果采用SPSS20.0軟件進行統計學分析。

2 結果

2.1條件優化

2.1.1包被磁珠保護液緩沖條件 本研究中，磁珠包被結束后保護液的選擇至關重要，圖1A表明，使用0.02 mol/L PBS作為保護緩沖液時，檢測信號值達到最大，且相關性也較好，故體系緩沖液采用0.02 mol/L PBS。

圖1 IL-6磁微粒化學發光檢測試劑條件優化Fig.1 Optimization of conditions for IL-6 magnetic particle chemiluminescence reagent

2.1.2包被抗體濃度 由圖1B可知，隨包被抗體濃度增加，發光信號值并沒有明顯升高，說明當包被抗體濃度為10 μg/ml已達到飽和狀態，故將包被抗體濃度定為10 μg/ml。

2.1.3酶標記抗體濃度 隨標記抗體濃度的增大，信號值逐漸升高，但陰性值區信號值也增大，導致陽性和陰性濃度比值(P/N)減小，低值標本區分度較差。綜合考慮信號值和本底問題，選擇酶標記抗體濃度0.2 μg/ml為最佳標記抗體濃度，見表1。

表1 IL-6酶標記抗體濃度檢測結果Tab.1 Results of labeled antibody concentrations

2.2標準曲線 依次配制不同濃度的國際標準品(1 000、500、200、50、5、0 pg/ml)，采用每個濃度重復檢測3次，得到一組對應的IL-6濃度與發光信號強度值。建立四參數擬合數學模型，以濃度的lg值為X，以光信號強度的lg值為Y，函數方程為Y=(8.270 65-3.725 51)/[1+(X/35.563 55)^(-0.489 29)]+3.725 51，R2=0.999，見圖2。

圖2 IL-6磁微粒化學發光檢測試劑標準曲線Fig.2 Standard curve of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3分析性能評估

2.3.1靈敏度 按照CLSI EP17-A文件，對靈敏度的測試結果進行分析和計算，得到LoB、LoD、FS各為0.5 pg/ml、2 pg/ml、2.5 pg/ml。

2.3.2精密性 對高、中、低值三個標本分別80個數據進行分析，結果顯示，分析內精密度、分析間精密度均小于10%，總不精密度小于15%，見表2。

表2 IL-6磁微粒化學發光檢測試劑精密度檢測結果Tab.2 Precision of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.3線性范圍 10組線性標本回歸方程的相關系數R2均大于0.990，且每個標本的實際測得濃度與理論濃度的相對偏差均小于10%，以一組標本為例，具體數據見表3。因此本研究建立的IL-6檢測方法的線性范圍為3～1 000 pg/ml。

表3 IL-6磁微粒化學發光檢測試劑線性范圍檢測結果Tab.3 Linear range of IL-6 magnetic particle chemilum-inescence assay

2.3.4最大稀釋倍數 由表4可得，此方法中稀釋倍數為8，10個標本的偏差均 ≤ 15%，故此方法的最大稀釋倍數為8倍。

表4 IL-6磁微粒化學發光檢測試劑最大稀釋倍數檢測結果Tab.4 Maximum dilution factor of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.5準確度 選擇線性范圍內的高值血清，用接近0值的陰性血清按1∶9的比例稀釋，制成回收標本，回收率在(100±15)%為符合需要。由表5可知，實驗中的10個標本的回收率均在誤差范圍內，故此方法的回收率滿足要求。

表5 IL-6磁微粒化學發光檢測試劑回收率檢測結果Tab.5 Recovery rate of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.6干擾實驗 準備IL-6濃度高、低值血清待測標本，分別將不同濃度的血紅蛋白、三酰甘油、 膽紅素加入2份待測標本中作為干擾標本，同時以添加相同體積的體系緩沖液作為基礎標本，來得到干擾率，由表6可知，血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素濃度分別≤200 mg/dl、2 000 mg/dl、45 mg/dl時，干擾率≤15%IL-6的檢測結果無顯著影響。

表6 IL-6磁微粒化學發光檢測試劑干擾實驗檢測結果Tab.6 Interference rate of IL-6 magnetic particle chemiluminescence assay

2.3.7方法學比對 根據EP09-A2文件，采用安圖和羅氏操作系統，分別測定100份臨床血清，以羅氏IL-6檢測結果為X軸，以基于本方法的安圖IL-6檢測結果為Y軸，如圖3所示，線性回歸方程為：Y=0.955 X+9.263，R2=0.993 2。

圖3 兩種系統測試結果相關性擬合曲線Fig.3 Correlation curve of test results of two system

3 討論

IL-6是一種功能廣泛的細胞因子，也是一種重要的炎癥因子，在發生內外傷、外科手術、感染、腦死亡及其他情況的急性炎癥反應過程中，IL-6會快速生成，同時IL-6在慢性炎癥反應(如類風濕關節炎)中也扮演重要角色[11，12]。能夠準確快速地定量檢測體內血清或血漿中IL-6水平，對炎癥、感染性疾病等患者具有重要的臨床指導意義。本研究采用雙抗體夾心法，基于安圖磁微粒發光系統，建立了IL-6磁微粒化學發光定量檢測法。

本文介紹的IL-6檢測方法，其LoB、LoD、FS分別為0.5 pg/ml、2 pg/ml、2.5 pg/ml；且精密度良好，分析內變異≤7%，分析間變異≤10%，總不精密度≤12%；線性范圍3～1 000 pg/ml，若有超限標本，最大稀釋倍數為8倍，即將超限標本與稀釋液最大按1∶7稀釋可計算其具體濃度；其回收率在(100±15)%以內，符合要求；另外，標本中的血紅蛋白、三酰甘油、膽紅素濃度分別為200 mg/dl、2 000 mg/dl、45 mg/dl時，其檢測結果基本不受影響。且利用本檢測系統與試劑與羅氏檢測系統與試劑平行檢測100份血清標本，結果顯示二者有較高的擬合性，其斜率為0.955，相關性R2≥ 0.99。

本研究建立的IL-6定量檢測的方法具有快速、高通量、高靈敏度、高精密度和高特異性等優點，可滿足臨床IL-6定量分析的需要，為術后患者恢復過程的監測及炎癥甚至膿毒癥的早期臨床預警診斷提供幫助，如反映炎癥活動情況及疾病嚴重程度，且與進口試劑相比價格相對低廉，性價比高，能夠緩解患者的經濟負擔，有較大的臨床使用價值。