非小細胞肺癌組織中lncRNA DB327252的表達及臨床意義

胡思遠 陳 燕 朱佳龍 侯 量 尹來波

(石河子大學第一附屬醫院心胸外科，石河子 832000)

隨著環境變化，肺癌的發病率逐年增高，嚴重影響公眾健康[1]。非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)是肺癌中最常見的一種類型，占全部肺癌的80%左右[2]。以CT為代表的影像學方法是臨床上篩查NSCLC的主要手段，但由于肺組織本身的質地、影像學診斷方法的靈敏度，并不能完全滿足臨床需要[3]。因此尋找NSCLC的新型篩查與早期診斷方法，加強檢測手段靈敏度，同時減少檢測造成的創傷與花費，是提高NSCLC臨床診療方案的發展方向。隨著表觀遺傳學不斷發展，研究者發現肺組織的癌變的一大因素是多種基因的異常改變，包括編碼區及非編碼區靶基因的抑制或過表達[4]。長鏈非編碼(long non-coding RNA，lncRNA)是一類長度超過200 nt的不編碼蛋白質的RNA，研究表明，lncRNA通過調控基因的表達廣泛參與機體的多種生理、病理過程，尤其在多種惡性腫瘤中異常表達，有成為腫瘤標記物的潛力[5]。本研究選擇lncRNA DB327252為研究對象，以實時熒光定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測lncRNA DB327252表達，以探討其在NSCLC的發生與惡性進展過程中的作用，并預測其成為NSCLC診斷、預后相關腫瘤標志的可能性。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1臨床資料 經本院醫學倫理委員會批準，患者及家屬知情同意，選取2015年6月～2017年3月我院收治的NSCLC患者91例，后依據排除標準排除11例，因失訪排除1例，共入組79例。本院NSCLC確診標準依據2015年第1版《NCCN非小細胞肺癌臨床實踐指南》[6]。樣本由根治性或姑息性切除術于術中切取，NSCLC組織取自腫瘤組織中心，癌旁組織為腫瘤邊緣的正常組織。另取20例同期肺外傷患者的正常肺組織作為對照。本研究選擇的NSCLC患者中，年齡≤55歲35例，55歲以上44例，平均年齡(59±7.22)歲；男性45例，女性34例；病歷資料顯示無吸煙史31例，有吸煙史48例；經病理科診斷，組織學類型為腺癌49例，鱗癌29例，鱗腺癌1例；腫瘤直徑≤3 cm者45例，>3 cm者34例；依據2009年修訂后的第7版NSCLC國際分期[7]分為：TNM分期Ⅰ期3例，Ⅱ期31例，Ⅲ期20例，Ⅳ期25例；無淋巴結轉移27例，有淋巴結轉移52例。

本研究納入標準為：①臨床病歷資料、隨訪資料完整，凍存標本保存完好；②經病理科確診為原發性NSCLC；③術前未經放、化療等其他抗腫瘤手段治療。排除標準為：①患者未遵醫囑按療程治療；②患有影響qRT-PCR結果的疾病；③患有顯著影響生存時間的其他嚴重疾病；④患者意外身故。

1.1.2試劑與儀器 TRIzol試劑(美國Invitrogen公司)；PrimeScript RT試劑盒(日本TaKaRa公司)；DEPC處理水(信帆生物)；BeyoFASTTMSYBR qPCR Mix(上海聯邁生物工程有限公司)；逆轉錄試劑盒(美國Fermentas公司)；無水乙醇和氯仿均購自國藥集團。UV-8000型紫外分光光度計(上海精密儀器儀表有限公司)；T100型PCR儀(美國Bio-Rad公司)；S700型切片機(深圳市瑞沃德生命科技有限公司)；PRO200型電動勻漿機(德國FLUKO公司)；移液槍(吉爾森P型移液器公司)。

1.2方法

1.2.1qRT-PCR檢測lncRNA DB327252表達 每份凍存標本稱取100 mg樣本，TRIzol法提取總RNA，以紫外分光光度計檢測總RNA純度，取OD260/OD280在1.8～2.0之間的總RNA樣本。利用PrimeScript RT試劑盒將總RNA逆轉錄為cDNA。qRT-PCR反應體系為30 μl，檢測過程嚴格遵循BeyoFastTMSYBR qPCR Mix說明書。以GAPDH為內參，反應引物序列為：①lncRNA DB327252：F：5′-AGCTCTCCTTCCCCTCTCAG-3′，R：5′-ATCTGAATGCCAGCAAGGCT-3′；②GAPDH：F：5′-GTCAACGGATTTGGTCTGTATT-3′，R：5′-AGTCTTCTGGGTGGCAGTGAT-3′。 以2-ΔΔCt法計算lncRNA DB327252的相對表達量。

1.2.2隨訪 以患者出院為觀察起點，利用電話、電子通訊，結合患者復診病歷，對患者及家屬進行隨訪。隨訪截止于2017年12月，隨訪時長9～21個月，平均(12.79±5.67)個月，中位隨訪時長為11個月。

2 結果

2.1lncRNA DB327252在不同肺組織中表達 由表1可知，lncRNA DB327252在NSCLC組織中表達水平(2.472±0.381)明顯高于癌旁組織(1.267±0.179)與正常肺組織(1.005±0.213)(P<0.05)。

2.2NSCLC 組織中lncRNA DB327252表達水平與臨床病理參數關系 NSCLC組織中lncRNA DB327252的表達水平與吸煙史、組織學類型、腫瘤大小、TNM分期密切相關(P<0.05)，與患者年齡、性別、淋巴結轉移無關(P>0.05)。見表1。

表1 NSCLC組織中lncRNA DB327252的表達與患者臨床病理參數關系Tab.1 Relationship between expression of lncRNA DB327252 in NSCLC tissues and clinicopatholo-gical parameters of

2.3NSCLC 組織中lncRNA DB327252表達水平與患者預后的關系 以NSCLC組織中lncRNA DB327252表達水平的算術平均數0.472將患者分為低表達組38例與高表達組41例，將隨訪結果繪制成Kaplan-Meier生存曲線(圖1)。由此可知，lncRNA DB327252低表達組患者生存率為67.6%，中位生存時間為(46.92±3.30)個月，95%CI為(35.74，47.18)個月，lncRNA DB327252高表達組生存率為34.1%，中位生存時間為(41.46±12.92)個月，95%CI為(340.466，53.37)個月。Log Rank統計結果顯示，lncRNA DB327252低表達組患者預后顯著優于lncRNA DB327252高表達組患者(χ2=7.900，P=0.005)。

圖1 Kaplan-Meier分析NSCLC 組織中lncRNA DB327252的表達對患者預后的影響Fig.1 Kaplan-Meier analysis of effect of expression of lncRNA DB327252 in NSCLC tissues on prognosis of patients

3 討論

據公共衛生部門統計，在我國，以NSCLC為代表的肺癌的發病率及死亡率具有一定的性別差異，其中男性發病率及死亡率均為所有惡性腫瘤最高，女性發病率為第四，死亡率位居第二，均屬于惡性腫瘤的前列，是我國國民健康的一大威脅[8]。NSCLC初期癥狀較輕，以胸部隱痛、悶痛等非特異性癥狀為主，影像學特征不明顯，多數患者確診時已為晚期，5年生存率僅20%左右[9]。外科手術結合術后化療、放療等綜合抗腫瘤治療方案是目前臨床上治療NSCLC的主要手段[10]。目前臨床確診NSCLC的金標準依然是常規病理切片光鏡檢查，但由于腫瘤組織的異質性、切片部位大小及診斷醫師的能力等多種因素，一般無法做到準確的分型，進而影響治療方案的個體化，臨床上治療方案總體有效率僅在30%上下波動，患者的中位生存時間僅為1年左右[11]。因而臨床亟需尋找能夠應用于早期診斷、明確診斷及評估患者預后的生物標記物。

關于腫瘤生物學機制的研究，一開始的焦點在于各種編碼蛋白質基因的表達調控與突變，隨著表觀遺傳學的發展，研究者發現非編碼基因同樣具有重要的生物學功能[12]。依據轉錄本長度而得名的lncRNA是非編碼RNA中研究較少的一類，近來的研究表明lncRNA與機體的各項生理與病理活動密切相關，基因層級上表現為參與基因轉錄調節與轉錄后調節、細胞周期調控等，臨床上則與心血管系統、退行性疾病、結核等感染性疾病及多種腫瘤的發生發展及預后相關[13-21]。由于研究時間較短，目前功能明確的lncRNA僅有少數，但已發現數種lncRNA與NSCLC相關。Zhang等[22]對比NSCLC與非腫瘤癌旁組織中多種lncRNA的表達情況發現，促癌基因lncRNA HOTAIR、H19與MALAT1在NSCLC組織中呈高表達，而lncRNA PANDAR與TUG1的表達則被顯著抑制，同時后續隨訪結果則表明納入該研究的lncRNA均顯示出顯著的預后評估功能。Sun等[23]則發現，lncRNA XIST的表達與NSCLC對順鉑的耐藥性相關，而敲除了lncRNA XIST的腫瘤組織耐藥性有所回落，因此lncRNA XIST可能作為促進化療藥物療效的靶點得到臨床應用。本研究則探討了一種新的lncRNA在NSCLC臨床診療活動中可能的應用前景。

本研究結果顯示，lncRNA DB327252在NSCLC組織的表達顯著高于非腫瘤癌旁組織與正常肺組織中，因此lncRNA DB327252有成為肺癌早期篩查標志的潛力。而具有吸煙史、腫瘤較大、TNM分期較晚的NSCLC患者組織中lncRNA DB327252的表達顯著高于對照組，且與性別、年齡無關，提示lncRNA DB327252的表達與NSCLC的惡性程度相關，其可能參與NSCLC的惡性進展。同時，lncRNA DB327252的表達與淋巴結轉移無關，提示lncRNA DB327252對NSCLC的促進應當在于腫瘤細胞的增殖、凋亡等方面，而與轉移、侵襲無關。但具體的機制尚需進一步的實驗證實。

本研究隨訪結果顯示，lncRNA DB327252表達較高的患者組生存時間、生存率等預后指標均顯著差于lncRNA DB327252表達較低的患者組，因此lncRNA DB327252具有一定的預后評估潛力。對lncRNA DB327252表達較高的NSCLC患者，應適當采用聯合抗腫瘤治療方案，注意復診，加強監護，以改善患者預后。

綜上所述，lncRNA DB327252在NSCLC組織中異常高表達，lncRNA DB327252表達較高的NSCLC惡性程度較高，且與患者預后相關。因此lncRNA DB327252有成為NSCLC早期篩查、預后評估相關腫瘤標記物的潛力。