通絡頸肩巴布劑離體小鼠經皮滲透行為及其動力學考察研究

鄭小燕，張慧慧，黃倩倩，申玉婷

(陽江市中醫醫院，廣東 陽江 529500)

神經根型頸椎病屬中醫“痹證”“頸肩痛”范疇。《素問·長刺節論》曰：“病在骨，骨重不可舉，骨髓酸痛，寒氣至，名曰骨痹。”臨床治以升陽解肌、通絡止痹，提高治療神經根型頸椎病的療效，達到科學、有效、價廉、安全可靠的目的。

通絡頸肩巴布劑處方由葛根、黃芪、威靈仙、全蝎、甘草等八味中藥組成，為陽江市中醫醫院針灸科臨床使用多年的外用敷貼，其臨床應用是將該處方中藥打粉，蜂蜜調和后，貼敷于病灶部位，臨床療效確切，深受患者認可。隨后改良為更適合患者使用的載藥量大，且無刺激性的巴布劑，該制劑通過升陽解肌、通絡止痹之功效對頸椎病具有很好的臨床療效。本研究考察制備的巴布劑的透皮性能，選擇君藥葛根中有效成分葛根素為檢測指標，考察其體外釋放度、離體透皮率及制備的巴布劑動力學釋放行為，具體研究如下。

1 實驗儀器與材料

1.1 實驗儀器

高效液相色譜儀：waters e2695；色譜柱：賽諾菲ODS HYPERSIC C18分析柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；電子天平：Sartorius ME215S(Max210 g d=0.01 mg)；RYJ-6A型藥物透皮擴散試驗儀(上海黃海藥檢儀器廠)；超純水機(上海惠分科學分析儀器有限公司)；KQ-300DE型醫用數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 材料

通絡頸肩巴布劑(自制，批號：20041801、20041802、20041803)；葛根素(中國食品藥品檢定研究院)，批號：110752-200511)；甲醇為色譜純，水為重蒸水，其他試劑均為分析純；清潔級小鼠，體重(20±5)g，由湖北省疾病控制中心動物實驗室提供，合格證號：(NO.4200695787)，實驗動物許可證號：SCXK(鄂)2019-0030。

2 條件與方法

2.1 色譜條件

色譜柱：C18分析柱(200 mm×4.6 mm，5 μm)；流動相：甲醇-水(22∶78)檢測波長為250 nm，理論塔板數按葛根素峰計算應不低于2 000。流速：1.0 mL/min；柱溫：30 ℃；進樣：20 μL。

2.2 樣品的制備

2.2.1 葛根素對照品溶液的制備 分別精密稱取葛根素(15.97 mg、16.02 mg)，分別置于200 mL容量瓶中，加30%乙醇，制成每1 mL含0.079 85 mg、0.080 1 mg的溶液，作為對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液的制備 取自制的通絡頸肩巴布劑一貼(批號：20041801)，除去蓋襯，稱取膏體約0.4 g，精密稱定，置于100 mL錐形瓶中，密封，精密加入60%乙醇50 mL，稱重，超聲處理15 min(120 W，頻率40 kHz)，放冷，用60%的乙醇補重，過濾，取續濾液，即為供試品溶液。

2.2.3 陰性溶液的制備 稱取不含葛根的其余藥材，自制成巴布劑，按上述“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，過濾，取續濾液即為陰性溶液。

3 方法專屬性

3.1 DAD檢測器純度檢驗

吸取葛根素對照品溶液、供試品溶液各10 μL，進入DAD檢測器對其進行純度檢查，結果表明葛根素色譜峰無雜質干擾，純度高(95.5%)。見圖1、圖2。

3.2 專屬性考察

按“2.1”項下色譜條件，分別將對照品溶液、供試品、陰性溶液各10 μL，進樣、檢測，對照品、供試品在14 min左右出現葛根素色譜峰，陰性溶液無干擾。結果見圖3、圖4、圖5。

圖1 對照品DAD檢測器純度檢驗

圖2 供試品DAD檢測器純度檢驗

圖3 葛根素對照品色譜

圖4 供試品色譜

圖5 陰性溶液色譜

3.3 線性關系試驗

精密稱取葛根素對照品16.02 mg，置于50 mL容量瓶中，加30%乙醇溶液稀釋至刻度，搖勻，作為母液，分別在上述色譜條件下分別進樣1 μL、4 μL、8 μL、12 μL、16 μL、20 μL，分別進樣2次，測定峰面積，計算平均峰面積，以平均峰面積、對照品含量計算線性回歸方程：Y=4 224 309.291 9X-181 722.420 8(r=0.999 9)；表明葛根素在0.320 4 μg～6.408 0 μg范圍內線性關系良好。

3.4 精密度試驗

取上述“2.2.1”項下制備的對照品溶液，按“2.1”色譜條件，連續進樣6次，每次進樣10 μL，計算葛根素的峰面積RSD為0.69%，表明儀器精密度良好。

3.5 穩定性試驗

取通絡頸肩巴布劑一貼(批號：20041801)，除去蓋襯，稱取膏體約0.5 g，精密稱定，置于錐形瓶中，密封，精密加入30%乙醇50 mL，稱重，超聲處理20 min(120 W，頻率40 kHz)，放冷，用30%的乙醇補重，過濾，取續濾液，按“2.1”色譜條件下，分別于1、2、4、8、12、24 h進樣檢測，分別進樣10 μL，計算葛根素的峰面積RSD為1.35%，表明溶液在24 h內穩定性良好。

3.6 重復性試驗

取通絡頸肩巴布劑一貼(批號：20041801)，除去蓋襯，稱取膏體約0.5 g，稱取6份，精密稱定，置于錐形瓶中，密封，分別精密加入30%乙醇50 mL，稱重，超聲處理20 min(120 W，頻率40 kHz)，放冷，用30%的乙醇補重，過濾，取續濾液，按“2.1”色譜條件下，分別進樣10 μL，計算葛根素的含量為280.42 μg/g，計算RSD為1.36%，表明實驗方法穩定可行。

3.7 加樣回收率試驗

取已知含量樣品(批號：20041801)，搖勻，除去蓋襯，稱取膏體約0.25 g，稱取6份，精密稱定，各精密加入適量的葛根素對照品，分別精密加入30%乙醇50 mL，稱重，按上述“2.2.2”項下供試品溶液制備方法制備，搖勻，過濾，取續濾液即得，分別進樣10 μL，結果平均回收率為100.16%，RSD為1.42%，表明實驗方法穩定可行。結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果

3.8 耐受性試驗

取上述“2.2.2”項下制備的供試品樣品，按“2.1”項色譜條件，分別在三根不同的色譜柱上測定葛根素的含量。結果表明在三根不同的色譜柱上測定結果無明顯差異。結果見表2。

表2 葛根素含量測定結果

3.9 定量限試驗

精密稱取葛根素對照品5.25 mg，置于50 mL容量瓶中，加30%乙醇定容至刻度，搖勻，作為儲備液，稀釋成一系列濃度的溶液，分別進樣1 μL，檢測，當信噪比S/N=10即為定量限，此時葛根素含量為5.08×10-3μg。

3.10 含量測定

取三批樣品，搖勻，按供試品溶液制法所得溶液，按上述“2.1”項色譜條件測定，進樣10 μL，計算。結果見表3。

表3 三批驗證樣品含量測定結果 (μg/g)

4 離體小鼠透皮率測定

4.1 離體小鼠透皮實驗[1-2]

取清潔級小鼠，脫頸處死，用電動剃刀將其腹部脫毛，脫毛切記不要損害外部皮膚，剝離小鼠皮膚，采用改良Franz擴散池，將鼠皮置于接收池上，稱取通絡頸肩巴布劑0.50 g，精密稱定，貼敷于鼠皮部，將接收池內加滿9%生理鹽水，水浴恒溫保持在(37±1) ℃，開啟磁力攪拌(設置攪拌速度為250 r/min)，分別于1、2、4、8、12、24 h取出接收池中的接收液，同時補充同量的恒溫生理鹽水(37±1) ℃。

4.2 通絡頸肩巴布劑透皮供試品溶液制備

分別將6個時間段接收液分別置水浴鍋蒸干，用30%乙醇溶液溶解，轉移至1 mL容量瓶中，并定容至刻度、搖勻，過濾，取續濾液即得。

4.3 離體透皮率含量測定

將上述制備的樣品，按“2.1”項色譜條件分別注入高效液相色譜儀，分別進樣10 μL，檢測，計算樣品中葛根素的含量及計算經皮滲透的動力學擬合。結果見表4、表5。

5 結果

由表5結果可知，通絡頸肩巴布劑中葛根素經皮滲透動力學擬合符合Higuchi方程，擬合度為0.918，表明葛根素有效組分含量逐步緩慢釋放，在皮膚角質層進行貯庫蓄積，從而進行低速運輸，表明該制劑為骨架型緩釋制劑。

表4 離體透皮率測定結果

表5 經皮滲透動力學擬合方程

6 討論

現代藥理研究證實，葛根素能顯著增加頸椎肌肉群收縮力，增加肌纖維彈性，軟化韌帶，可阻止椎間盤纖維化和椎間盤退變[3]。

神經根型頸椎病是頸椎病中的常見臨床亞型，在所有類型中它的發病率最高，占70.2%。其主要表現為頸肩臂部疼痛，上肢放射性麻木疼痛，上肢肌力減退，甚者出現肌肉萎縮[4]。

本實驗制備的巴布劑通過藥動學擬合，發現為骨架型透皮制劑。骨架型透皮貼比貯庫型更薄更小，且皮膚刺激性小，因此，患者的順應性更好，為目前經皮領域研究的熱點[5]。制備的通絡頸肩巴布劑緩控釋制劑可實現藥物釋放的定時、定位、定速，從而可使藥物發揮出更好的療效。