三七總皂苷對過氧化氫所致內皮細胞損傷的保護作用

謝 鵬，劉金海，耿勝男，張萌萌，張會麗

(鄭州工業應用技術學院 藥學與化學工程學院，河南 鄭州 450000)

動脈粥樣硬化(AS)是一種血管內毒素堆積導致的非炎癥性病變，具體病因目前仍未闡明[1-4]。研究表明，影響動脈粥樣硬化的重要因素是氧化應激所產生的活性氧(ROS)[5-6]。內皮細胞數量穩定和血管功能正常的動態平衡是通過內皮細胞損傷與增殖來實現的[7-8]。因此，有效地控制內皮細胞受損、保護內皮細胞的氧化應激性對AS具有積極的作用[9-11]。PNS是從三七中提取分離得到，研究發現，其含有皂苷活性物質、微量元素、豐富的維生素等[12]。PNS能減少機體氧的消耗量，增強機體對氧的耐受力，還可以使腦血管擴張，血流量增加，具有抗血栓和抗凝血的功能，具有改善動脈粥樣硬化程度等廣泛的藥理作用[13-17]。H2O2是一種主要的活性氧，能誘導內皮細胞的保護能力。本實驗研究不同濃度的PNS對HUVECs損傷的影響。

1 材料

1.1 實驗細胞

人臍靜脈血管內皮細胞(中國科學院細胞庫)。

1.2 實驗儀器與試劑

二氧化碳培養箱(Thermos)；低溫離心機(Eppendorf)；電子天平(Sartorius)；高壓蒸汽滅菌鍋(施都凱儀器設備有限公司)；酶標儀(美國伯騰儀器有限公司)；電泳儀(上海天能有限公司)；細胞粉碎機(Eppendorf)；顯微鏡(上海測維光電技術有限公司)；PCR儀(杭州郎基科學儀器有限公司)；凝膠成像系統(上海天能科技有限公司)。

三羥甲基氨基甲烷、甘氨酸、十二烷基硫酸鈉、丙烯酰胺(sigma試劑有限公司)；吐溫-20(國藥集團化學試劑有限公司)；BSA蛋白濃度試劑盒(碧云天生物技術公司)；FDA染色劑(阿拉丁試劑有限公司)；預染marker(上海雅酶生物科技有限公司)；細胞裂解液(碧云天生物技術公司)；氯仿、乙醇、異丙醇(成都市科龍化工試劑廠)；三七總皂苷、MTT(Sigma-Aldrich)；MDA、SOD、LDH、GSH、GAPDH抗體(Cell Signaling公司)。

2 方法

2.1 細胞復蘇和傳代

37 ℃解凍細胞，轉移至離心管，加10%完全培養基，1 000 rpm離心5 min，倒掉上清液。將細胞懸液繼續培養，實時更換培養液。

將原代細胞培養24 h后，觀察細胞密度是否達到80%～90%，再進行傳代。取出HUVECs，將2 mL無菌PBS緩沖液輕輕沖洗細胞培養瓶壁2次。適量胰酶消化，加入10%完全培養液2 mL。緩慢吹打瓶壁，使細胞完全脫離。轉移至離心管中1 000 rpm離心5 min。根據細胞數量和生長狀況，將細胞轉移到新培養瓶中，標記好細胞傳代時間和次數等信息。觀察細胞密度和狀態，繼續培養，選擇形狀相對穩定的第3～5代的胞用于實驗研究。對細胞進行計數。將細胞懸液以每孔1×104的密度接種至96孔板，以每孔6×104的密度接種培養皿，繼續培養至完全貼壁。

2.2 分組及給藥

將完全貼壁的細胞取出，并對其進行分組。空白組細胞不施加任何干預因素；過氧化氫組細胞加入過氧化氫，終濃度為500 μmol/L；PNS-H組細胞加入PNS，終濃度為60 μmol/L，30 min后再加入H2O2作用；PNS-L組細胞加入PNS，終濃度為30 μmol/L，30 min后再加入H2O2作用。繼續培養24 h。

2.3 蛋白免疫印跡檢測蛋白

按照實驗需求對細胞進行實驗處理，在收集的細胞中加入適量預冷的含有PMSF及磷酸酶抑制劑的裂解液(1 mL的裂解液加入100 μL的PMSF)，4 ℃裂解30 min，12 000 r/min低溫離心10 min，轉移上清液。備用。

2.3.1 考馬斯亮藍法測蛋白濃度 本實驗中所使用的蛋白標準品(BSA)的濃度為0.5 mg/mL，依據表1進行添加，上樣，記錄。加100 μL考馬斯亮藍染色液，靜置觀察。用酶標儀在562 nm的波長下測定。

表 1 蛋白濃度梯度

2.3.2 電泳樣本的制備 在制好的蛋白樣品中加200 μL 5X上樣緩沖液(5X倍，1∶4=緩沖液∶樣本)。用沸水加熱15 min使其充分變相。

2.3.3 Western blot檢測蛋白的表達 本實驗分離膠為12%的分離膠和5%的壓縮膠配制而成。根據考馬斯亮藍法所測定的蛋白樣品濃度計算所需上樣量，然后加入1/4蛋白體積的5X上樣緩沖液，混勻后在沸水中煮15 min，制得蛋白樣品。在1.5 mm玻璃板中加入7～8 mL的分離膠，加入2～3 mL異丙醇封壓，排出氣泡，凝結后，棄異丙醇，加壓縮膠，加梳子，制得膠。將電泳套件置于電泳槽中，加入新鮮電泳液浸泡。垂直拔下梳子，用上樣針吸取所需的蛋白樣品加到凝膠加樣孔內，加雙色預染蛋白Maker。電壓設為低電壓80 V，待Marker基本分離后加大電壓，直至電泳結束。設定轉膜電壓為110 V，時間75 min。切取PVDF膜，活化，倒入轉膜液，加冰轉膜。將蛋白膜放在5%脫脂牛奶封閉液中，37 ℃封閉1 h。加入按照1∶25 000稀釋(1X TBS-T稀釋)的一抗，4 ℃孵育過夜。1X TBST漂洗 PVDF膜4～5次，每次10 min。加入按照1∶25 000稀釋好的二抗，37 ℃孵育1 h。洗膜，將PVDF膜放在顯影儀上，撒上發光液，運行軟件，選擇化學發光，設置曝光時間，進行5 s、10 s拍照。

2.4 PCR檢測相關基因

2.4.1 總RNA的抽提 按照實驗要求對樣本進行處理，將裂解的細胞勻漿，加入0.2 mL氯仿，渦旋，室溫放置15 min。對不同細胞進行編號。2～8 ℃，10 000 r離心15 min，用移液器將上層水相轉移至新Ep管中，加入500 μL的異丙醇，渦旋混勻，室溫放置10 min，2～8 ℃，10 000 r離心10 min，倒掉上清。加入75%的乙醇，渦旋10 s，2～8 ℃，7 500 r離心5 min，棄上清。放置在吸水紙上，進行RNA沉淀干燥處理，加入50 μL水，混勻。

2.4.2 RNA逆轉錄 第一鏈進行cDNA的合成，去基因組DNA反應，按照說明進行溶液配置，42 ℃孵育5 min，4 ℃保存。將下表液體渦旋混勻后，進行逆轉錄，50 ℃孵育30 min，75 ℃孵育5 min，終止反應。得到含有cDNA的混合液體，每個樣本需進行4個目的基因的PCR實驗，重復3次測試，把逆轉錄的4個含cDNA的樣本均稀釋3倍。然后再進行PCR實驗，剩余cDNA凍存。

對人臍靜脈內皮細胞SOD、CAT、MDA、LDH、GSH這5個基因的ID進行查詢與設計，再進行基因序列的合成。

引物合成后離心處理，稀釋，使所有引物的終濃度達到所需終濃度。PCR測試采用MonAmpTMChemoHS Qpcr Mix(None Rox)試劑，并按照該試劑說明書進行。進行30次循環，檢測完畢后，導出PCR數據。

表2 引物名稱及序列

2.5 MTT法檢測細胞活力

量取6 mLPBS溶液，稱取0.03 g的MTT粉末，溶解，混勻，0.22 μm微孔濾膜過濾，4 ℃避光保存。取出HUVECs的96孔板，每孔加入20 μL的MTT溶液，繼續培養4 h，吸取孔內的上清液，加入0.2 mL的DMSO，孵育3～5 min，用酶標儀在493 nm處測定吸光度，計算HUVECs存活率。細胞活力(%)=(實驗組-空白組)/(對照組-空白組)×100%。

2.6 FDA染色

取0.01 g的FDA粉末溶于1 mL的丙酮中，配成終濃度為10 mg/mL的母液，放于4 ℃冰箱，使用時按1∶1 000進行稀釋，取出HUVECs的6孔板，棄去培養液，加入稀釋過的FDA溶液0.1 mL，孵育20 min，棄去液體，用PBS沖洗2次，放置于488 nm的熒光顯微鏡下進行拍照。

3 結果

3.1 MTT檢測

由表3的實驗數據顯示，H2O2組和各PNS組與空白組進行對比，當PNS濃度為60 μmol/L，內皮細胞活性顯著增高(P<0.01)，表明此濃度對細胞損傷有保護作用。當PNS為30 μmol/L，細胞活力沒有明顯增高，藥物作用不明顯，但隨著劑量的增加，細胞存活率有所上升。

表3 不同濃度的PNS對H2O2損傷HUVECs活力的影響

3.2 FDA染色

由圖1可以看出，與H2O2組相比，當PNS濃度在60 μmol/L時，細胞的密度最大，存活率最高。當PNS濃度為30 μmol/L時，熒光效果不太明顯，細胞存活率不高，因此當PNS濃度為60 μmol/L時對細胞有很好的保護作用。

3.3 PCR檢測

由表4可以得出，不同濃度的PNS都會對SOD、MDA、LDH、GSH產生影響，空白組與H2O2組進行對比，SOD、MDA的水平升高(P<0.01)，LDH、GS的水平降低(P<0.01)。不同濃度的PNS組與H2O2組對比，PNS濃度在60 μmol/L時，SOD、MDA的顯著上升(P<0.01)，LDH、GSH下降(P<0.01)。因此PNS濃度為60 μmol/L時對HUVECs的保護作用最為明顯。

圖1 FDA染色圖

圖2 不同組別SOD、GSH、MDA、LDH蛋白表達水平

表4 不同組別SOD、GSH、MDA、LDH mRNA表達

由圖2可以看出，與H2O2組相比，SOD、MDA增加(P<0.01)，空白組減少(P<0.01)。與H2O2組相比，LDH、GSH在H2O2組中顯著減少(P<0.01)，而在空白組中表達量最多(P<0.05)。當PNS濃度為60 μmol/L時，對受損內皮細胞的修復能力最高。

4 結論

本實驗利用H2O2能透過細胞膜和核膜進入細胞內引起膜脂質過氧化反應[18]，導致內皮細胞嚴重損傷，從而引起疾病的發生，對人體造成不可預知的危害，建立細胞損傷模型。通過Western blot和PCR檢測發現PNS可抑制LDH、GSH的表達，并提高SOD、MDA的含量，說明PNS對受損內皮細胞的凋亡基因表達水平起到調控作用，且PNS高劑量組效果明顯，呈劑量依賴性。PNS在一定濃度可有效地保護血管內皮細胞免受H2O2的損害，對預防和治療動脈粥樣硬化有重要意義。