電針智三針對血管性癡呆大鼠學習記憶及EphA4/ephrinA3蛋白表達的影響

林 吉，魏宇唯，唐中生，朱正耀，朱世杰，寇云芳，謝高宇

(貴州中醫藥大學，貴州 貴陽 550025)

血管性癡呆(Vascular dementia,VaD)是指由缺血性卒中、出血性卒中和造成記憶、認知和行為等腦區低灌注的腦血管疾病所致的嚴重認知功能障礙綜合征，已經成為僅次于阿爾茨海默病(Alzheimer disease,AD)的致精神和軀體殘疾的主要因素之一，缺血性中風幸存者中有25%～30%會發展為立即或延遲的血管性認知障礙(Vascular cognitive impairment，VCI)或血管性癡呆(VaD)[1]。與AD不同，VaD是一種完全可預防、系統治療后能有效改善癥狀的疾病。因此，在疾病早期有效防治VaD有重大社會意義。有研究表明，突觸功能障礙在VCI和VaD的認知能力下降過程中，是造成學習記憶認知障礙的主要原因之一[2]。促紅細胞生成素產生的肝細胞受體(Erythropoietin-producing hepatocellular receptor，Eph)/肝配蛋白 (Ephrin)家族蛋白是酪氨酸激酶家族的最大成員[3]，按其序列同源性及與配體親和力可分為兩個亞組：EphA和EphB，Eph家族蛋白在人體各大系統均有作用，但對于其在神經系統中的作用機制的研究最為廣泛，研究顯示，Eph/ephrin信號通路在神經細胞遷移、軸突導向、自動調節細胞接觸、調節大腦細胞凋亡、調節腦血管生成中扮演了重要角色[4]。

研究證明，神經損傷可使大鼠海馬CA1區EphA4與ephrinA3的表達明顯增高，EphA4/ephrin信號通路通過調控神經元細胞參與腦缺血后的炎性損傷的過程[5]。但這一信號通路與VaD相關性尚不明確，本實驗通過制備VaD大鼠模型，分析VaD大鼠海馬CA1區EphA4/ephrinA3蛋白表達、血清白細胞介素-6(IL-6)、C反應蛋白(CRP)含量的變化，繼續探討電針智三針改善VaD大鼠學習記憶的可能機制，以期為臨床電針智三針治療VaD提供理論依據。

1 試驗材料

1.1 實驗動物

SPF級雄性SD大鼠80只，體質量約300～350 g,長沙市天勤生物技術有限公司提供，許可證號:SCXK (湘) 2014-0011。

1.2 儀器

手術器械1套,華佗牌針灸針(蘇州醫療用品廠，0.3 mm×40 mm)；電泳儀(Tanon，EPS-300)；超聲波細胞粉碎機(寧波榮順，RS-25S)；華佗牌SDZ-Ⅱ型電針治療儀 (蘇州醫療用品廠)；電子分析天平 (日本島津，AUW-220D)；板式酶標儀(北京新風機電，ZS-2)；立式超低溫保存箱(Haier，DW-86L386)；微孔板恒溫振蕩器(杭州米歐，ST70-2)；高速冷凍離心機(湘儀貝克，TGL-20M)等。

1.3 藥品與試劑

尼莫地平片(亞寶藥業集團股份有限公司,國藥準字H14022821)；戊巴比妥鈉(P3761,Sigma)；BCA蛋白定量試劑盒(康為世紀,CW0014)；一步法快速Western印跡試劑盒(康為世紀，兔CW02029、鼠CW02030)；ECL發光檢測試劑盒(康為世紀，CW0049)；蛋白酶抑制劑(康為世紀，CW2200S)；蛋白印跡膜再生液(康為世紀,CW0056)；Eph A4(博奧森，bs-1455R)；Ephrin A3(博奧森,bs-6047R)；IL-6(Elabscience，E-EL-R0015c)；CRP(Elabscience，E-EL-R0022c)等。

2 方法

2.1 VaD大鼠模型制備

大鼠適應性飼養1周，術前禁食12 h，禁水4 h后開始造模。用3%戊巴比妥鈉(1 mL/100 g)腹腔注射麻醉大鼠，將其俯臥位固定于手術臺上，在第1頸椎上方縱向剪開一個小口，用鑷子鈍性分離肌肉，暴露出頸椎翼小孔，用直徑0.5 mm電凝針插入頸椎翼小孔灼燒椎動脈1～2 s，使其永久性閉塞。24 h后，分離雙側頸總動脈，左、右頸總動脈分別不同時夾閉5 min，共夾閉3次，每次間隔10 h。假手術組除不結扎動脈外，其余操作相同。

2.2 實驗動物分組

將造模成功的大鼠按照前期課題組的設計隨機分組[6]：VaD模型組、尼莫地平組、電針智三針組，再配以假手術組進行比較，每組10只。

2.3 治療方法

術后第8天開始治療，治療時間為每天上午9點至11點，每日治療1次，連續治療20天，電針智三針操作均由同一人完成。電針智三針組：使用特制的固定器固定好大鼠頭部及四肢后，參照華興邦《實驗動物穴位圖譜》，以百會穴作為參照，于大鼠百會穴正中前下方2 mm處取神庭穴,神庭穴兩側旁開0.5 mm處取本神穴,采用1寸毫針于皮下平刺進針0.5寸，連接電針儀，施予連續波，20 Hz,治療20 min。尼莫地平組:按課題組之前的方法進行，每只大鼠按20 mg/(kg·d)的用量進行灌胃治療。VaD模型組和假手術組:每只大鼠每天給予1 mL/100 g蒸餾水灌胃。

2.4 Morris水迷宮測試大鼠行為學

定位航行實驗：將平臺固定于第一象限，水面高于平臺1 cm，水溫25～27 ℃之間。第1～6天進行定位航行實驗,以水迷宮四周的標志為參照物，每天分別將大鼠從平臺以外的其他3個不同象限面向池壁放入水中，記錄找到平臺所用時間,如未在規定時間內找到平臺,引導大鼠站在平臺上并停留10 s記憶參照物及路線,時間記為90 s。

空間探索實驗：上述實驗完成后次日，撤除平臺，將大鼠從第三象限放入水中，記錄90 s內大鼠穿越平臺區域次數。

2.5 ELISA檢測血清IL-6、CRP含量

用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠,腹主動脈采血3 000 r/min離心20 min取上清，收集血清分裝保存于-20 ℃冰箱備用。按照試劑盒說明書測定IL-6、CRP含量。

2.6 Western Blot檢測海馬CA1區EphA4/ephrinA3蛋白表達

用3%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，于劍突處剪開胸壁，暴露心臟，從主動脈根部用生理鹽水充分灌洗，之后迅速斷頭取腦，于冰上剝離兩側海馬。-80℃保存備用，等比例加入含蛋白抑制劑的裂解液，提取各組大鼠海馬組織蛋白。取上清液用BCA法進行蛋白定量，離心收集上清;30%Acr-Bis分離膠緩沖液,10%APS TEMED混勻,制備10%分離膠,靜置30～60 min靜置30～60 min，上樣,20 mA恒流電泳,待預染Marker條帶分離清晰、間距適宜時,停止電泳。200 mA恒流,低溫轉膜2 h。轉膜結束,使用一步法快速Western印跡試劑盒(康為世紀鼠CW2030,兔CW2029),加入封閉液中,20 min;另取二抗HRP至4 mL離心管中,再取一抗與二抗混勻,室溫孵育5 min,加入一步法抗體稀釋液。滴加ECL發光液顯影，以β-actin為內參。

2.7 統計學方法

采用SPSS 20.0統計軟件分析數據，結果以均數加減標準差表示，各組間比較采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，組間比較用 LSD檢驗，P<0.05為差異有統計學意義，P<0.01為差異有顯著統計學意義。

3 結果

3.1 各組大鼠空間學習能力檢測結果

與假手術組相比，VaD模型組大鼠搜尋平臺時間明顯延長(*P<0.05，**P<0.01)，表明造模后大鼠的學習記憶能力會出現明顯下降，證明VaD模型建立成功；電針智三針組和尼莫地平組尋找平臺所用時間比VaD模型組明顯縮短(△P<0.05，△△P<0.01),證明電針智三針能提高VaD大鼠學習能力。見表1。

表1 各組大鼠搜尋平臺時間

3.2 各組大鼠空間探索能力檢測結果

上述實驗完成后次日，撤除平臺，將大鼠從第三象限放入水中，記錄到VaD模型組大鼠穿越平臺象限次數明顯低于假手術組(P<0.01)，說明VaD大鼠空間探索能力下降，電針智三針組穿越平臺區域次數明顯增加(P<0.05)，說明電針智三針能提高VaD大鼠空間記憶能力。見表2。

表2 各組大鼠穿越平臺次數 次)

3.3 各組大鼠IL-6、CRP含量的變化

與假手術組比較，VaD模型組血清IL-6含量增加(P<0.05)、血清CRP含量顯著增加(P<0.01)。說明造模后大鼠腦缺血會產生全身性的炎癥反應。與VaD模型組比較，電針智三針組大鼠血清IL-6、CRP含量降低(P<0.05)。說明電針智三針治療后，減輕VaD大鼠腦缺血后的炎癥反應。見表3。

表3 各組大鼠血清IL-6、CRP含量

3.4 各組大鼠海馬CA1區EphA4/ephrinA3含量的變化

與假手術組比較，VaD模型組海馬CA1區EphA4蛋白表達增加(P<0.01)，ephrinA3蛋白表達增加(P<0.05)；與VaD模型組比較，電針智三針大鼠海馬CA1區EphA4蛋白表達降低(P<0.01)；ephrinA3蛋白表達降低(P<0.05)。見圖1、表4。

圖1 各組大鼠海馬CA1區EphA4/ephrinA3蛋白含量的表達

表4 各組大鼠海馬CA1區EphA4/ephrinA3蛋白含量的表達

4 討論

近年來，血管性癡呆(VaD)發病率正在迅速增加，在公共衛生和社會護理方面遭成了嚴重困擾，全世界大約有4 680萬人患有癡呆癥，每年有990萬新增病例[7]。因此，怎樣有效防治VaD成了目前癡呆和腦缺血領域的一個熱點。智三針由靳瑞教授所創，其主要選取位于前額部的神庭穴和雙側的本神穴，神庭穴在左右額肌的交界處，布有額神經分支，本神穴位于額肌中，布有額神經外側支，三個穴位正對應大腦額葉,額葉功能與記憶、判斷、認知、思考、操作密切相關[8]。

腦缺血時,細胞興奮毒性增強和能量衰竭,激發腦實質內的炎癥反應，其中IL-6是一種由多種炎癥細胞產生的細胞因子，能夠誘導磷脂酶合成分泌，經花生四烯酸途徑形成氧自由基，刺激溶酶體釋放，進而加重腦組織缺血缺氧和神經損傷[9]，其效應與濃度相關，IL-6通過影響突觸可塑性、神經元形態而影響認知功能。動物研究表明，腦缺血大鼠認知功能和行為改善與腦內的炎癥因子IL-6水平密切相關[10]，當IL-6濃度較低時,具有神經修復的作用,提高學習記憶能力。腦內缺血損傷使細胞膜發生分離，提高了CRP的附著點，在IL-6的信息傳導下，有活性的CRP隨之產生[11]。CRP是判斷炎性反應的重要指標之一，具有抑制炎癥反應發生、發展及減輕炎癥損傷的作用。正常情況下血清含量極少，當體內發生炎癥時迅速釋放升高，且其濃度與炎癥嚴重程度呈正比[12]。VaD大鼠模型中，CRP升高直接導致白細胞介素 (IL-1、IL-6)和自由基的大量釋放，引起血管痙攣，導致海馬組織缺血、缺氧。此外，CRP分解產生的多肽可以調節免疫活性，促進局部免疫調節障礙，加重神經損傷的程度，出現認知障礙[13]。

本實驗中，我們發現VaD模型組血清IL-6含量明顯高于假手術組，說明炎癥反應參與了腦缺血繼發性損傷的過程，而電針智三針治療后，血清IL-6含量下降，證明電針智三針的治療減輕了VaD大鼠炎癥反應，VaD大鼠的認知功能得到明顯改善。也證實在VaD模型組大鼠中，血清CRP含量高于假手術組，而電針智三針治療可以下調血清中CRP的含量，從而減輕VaD大鼠神經損傷的程度，有效改善VaD大鼠學習記憶能力。

研究發現，與其他記憶障礙疾病一樣，引起VaD的認知障礙的原因之一是突觸功能障礙甚至是喪失。EphA受體調節海馬組織的功能和可塑性[14]。研究顯示，腦缺血損傷可增加CA1區ephrinA3和EphA4蛋白的表達，EphA4可能通過肌動蛋白細胞骨架重組或黏附受體調節，并以蛋白酶體依賴性方式觸發AMPA受體降解，EphA4與ephrinA3相互產生作用，其過程涉及突觸修剪[15]。最新研究結果表明，抑制EphA4可以改善認知障礙小鼠模型中的社會記憶能力和認知功能，同時可觀察到海馬CA1區突觸形態發生改變，其改變特征是樹突棘長度和頭部寬度增加[16]。EphA4/ephrinA3在正常成人神經系統中表達水平極低，在神經損傷及星形膠質細胞活化時表達上調，EphA4缺乏會增加神經膠質谷氨酸轉運蛋白的水平，而ephrinA3會調節星形膠質細胞中的轉運蛋白電流。研究表明，EphA4/ephrinA3信號傳導是神經細胞調節突觸功能和可塑性的關鍵機制[14]。本研究采用電針智三針為治療方法，發現電針智三針組大鼠海馬CA1區EphA4/ephrinA3蛋白表達較VaD組呈下降趨勢，提示電針智三針能調節突觸的功能可塑性，有利于改善VaD大鼠的學習和記憶能力。

本課題組早期研究證實電針智三針可能通過調節海馬CA1區突觸前膜EphB2和突觸后膜ephrinB3表達，來改善VaD大鼠認知功能[6]。此次實驗通過電針智三針對大鼠海馬CA1區EphA4/ephrinA3蛋白表達的影響，從另一個角度探討了電針智三針對VaD大鼠認知功能改善的可能機制。本實驗在制備VaD大鼠的基礎上，應用電針智三針干預治療，觀察不同組別大鼠血清IL-6、CRP含量的變化以及海馬CA1區EphA4、ephrinA3蛋白的表達變化。結果發現：電針智三針治療后，VaD大鼠海馬CA1區EphA4、ephrinA3蛋白表達降低，同時下調了血清IL-6、CRP的含量，從而保護大鼠腦組織,減輕神經損傷程度，明顯提高了VaD大鼠的認知功能。該研究為臨床電針智三針治療VaD提供了一定的理論和實驗依據，至于EphA4/ephrinA3通路是通過何種途徑發揮作用的，課題組還將圍繞EphA4/ephrinA3通路繼續探討電針智三針改善VaD學習記憶的可能機制。