六味地黃丸濃縮丸多指標成分體外溶出度研究

吳崇樂，黃 勝*，顏冬蘭，胡麗彬，羅菲菲，葉惠煊

(1.九芝堂股份有限公司，湖南 長沙 410205；2.湖南省中藥固體制劑工程技術研究中心，湖南 長沙 410205；3.中藥驗方湖南省工程研究中心，湖南 長沙 410205)

隨著中藥質量控制技術的發展，許多化學藥品的質量控制理念與方法在中藥質量控制中得到逐步應用，如溶出度方法已逐漸應用于中藥篩選制劑處方與工藝和內在質量評價[1-2]。但溶出度在中藥丸劑的研究和應用較少，2015版《中國藥典》四部通則中，丸劑項僅規定了溶散時限的控制指標[3]。從臨床用藥情況分析，現行的溶散時限檢查不能全部反映體內的吸收和藥效情況，而溶出度試驗更能反映體內藥物的吸收情況。

六味地黃丸是傳統中醫滋陰補腎的經典名方，始見于宋代錢乙的《小兒藥證直訣》，由熟地黃、酒萸肉、牡丹皮、山藥、茯苓、澤瀉六味中藥材組成，主治腎陰虧損、頭暈耳鳴、腰膝酸軟、骨蒸潮熱、盜汗遺精、消渴等證[4]。目前，對六味地黃丸質量評價如指紋圖譜研究的報道較多[5-8]，但僅有少數關于六味地黃丸溶出度的報道研究，且主要集中在對丹皮酚單一成分或者丹皮酚、馬錢苷2種成分的溶出度進行評價[9-15]。

本實驗建立以馬錢苷、莫諾苷和丹皮酚為指標成分的溶出度測定方法，同時測定六味地黃丸馬錢苷、莫諾苷和丹皮酚的體外溶出度，為六味地黃丸的質量控制和評價提供依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

ZRS-8LD智能溶出試驗儀(天津市天大天發科技有限公司)；BS2202S電子天平(賽多利斯科儀器(北京)有限公司)；KQ-700DV型數控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)；Waters 2695-2998液相色譜儀(美國沃特斯公司)。

1.2 試劑與藥品

六味地黃丸：濃縮丸(廠家1，批號201903046；廠家2，批號19073262)。丹皮酚對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號110708-201407)。馬錢苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111640-201707)。莫諾苷對照品(中國食品藥品檢定研究院，批號111998-201602)。其他試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

參照《中國藥典》2015版六味地黃丸濃縮丸含量測定方法。

2.2 溶液制備

2.2.1 對照品溶液制備 分別精密稱取莫諾苷對照品10.35 mg、馬錢苷對照品10.31 mg和丹皮酚對照品20.25 mg，加入50%甲醇50 mL，溶解，搖勻，配制成每1 mL中含莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚分別為0.207 mg/mL、0.206 2 mg/mL、0.405 mg/mL的混合溶液，即得。并稀釋至刻度，搖勻即得對照品儲備液。

2.2.2 供試品溶液制備 參照《中國藥典》2015版四部0931(第二法)溶出測定法，以脫氣處理的pH=1.2鹽酸-氯化鈉溶液500 mL為溶出介質，溫度保持在(37±0.5)℃，轉速100 r·min-1，取供試品6份，每份約10 g，分別投入6個溶出杯內，立即啟動旋轉并開始計時，在規定時間點吸取溶液5 mL(每次取樣結束補充同溫同體積的釋放介質)，上清液經0.45 μm微孔濾膜濾過，取續濾液，即得供試品溶液。

2.3 線性關系考察

分別精密吸取1 mL、3 mL、5 mL、7 mL、9 mL對照品儲備液置于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀釋至刻度，進樣10 μL，測定峰面積。以峰面積Y為縱坐標，質量濃度X為橫坐標進行線性回歸，得回歸方程及相關系數見表1。結果表明莫諾苷在3.519～31.671 μg/mL，馬錢苷在4.005～36.045 μg/mL，丹皮酚在12.5～112.5 μg/mL范圍內有良好的線性關系。

表1 對照品溶液線性關系考察結果

2.4 精密度試驗

取丹皮酚、馬錢苷、莫諾苷混合標準溶液連續進樣6次，每次10 μL。結果莫諾苷的RSD為0.48%，馬錢苷的RSD為0.65%，丹皮酚的RSD為0.43%。

2.5 穩定性試驗

取溶出時間為4 h的六味地黃丸的溶出液于0 h、1 h、2 h、4 h、8 h、12 h進樣測定。結果莫諾苷的RSD為3.52%，馬錢苷的RSD為3.89%，丹皮酚的RSD為4.26%。表明供試品溶液在12 h內基本穩定。

2.6 重復性試驗

取同一批供試品 (批號：201903046)，按“2.2.2”項下方法平行制備6份，并進行含量測定，記錄峰面積，分別計算莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的含量，其含量測定結果的RSD值分別為0.95%、1.23%和1.58%。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱定已知含有量的六味地黃丸粉6份，分別精密稱定加入丹皮酚、馬錢苷、莫諾苷對照品，分別置于50 mL量瓶中，加甲醇充分溶解并稀釋至刻度，過濾，取續濾液1 mL加甲醇稀釋至10 mL，混勻，取10 μL進樣，測定峰面積，根據回歸方程計算馬錢苷、莫諾苷、丹皮酚的量及回收率，結果表明回收率良好。見表 2。

表2 加樣回收率試驗結果 (n=6)

2.8 溶出度的測定

按“2.2.2”項下操作，分別于5 min、15 min、30 min、45 min、60 min、90 min、2 h、4 h取樣5 mL，用0.45 μm微孔濾膜濾過，隨即補充等量的溶出介質，取續濾液10 μL進樣。按照“2.1”項下色譜條件測定峰面積，求算藥物質量濃度并換算成不同時間的累積溶出百分率，取平均值。結果見表3。

表3 不同廠家六味地黃丸濃縮丸多指標的累積溶出度 (n=6)

繪制溶出曲線。以表3中平均累積溶出度(%)為縱坐標，時間為橫坐標(min)繪制溶出曲線。不同廠家六味地黃丸濃縮丸中莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚的溶出曲線分別見圖1、圖2、圖3。

圖1 六味地黃丸濃縮丸中莫諾苷的溶出曲線

圖2 六味地黃丸濃縮丸中馬錢苷的溶出曲線

圖3 六味地黃丸濃縮丸中丹皮酚的溶出曲線

2.9 相似度評價

采用相似因子法進行分析[16]，比較2個廠家六味地黃丸濃縮丸的溶出度。

以廠1濃縮丸(批號：201903046)作為參比制劑，根據上述公式計算各溶出指標的f2值，結果見表6。莫諾苷、馬錢苷、丹皮酚的相似因子均大于75，表明不同廠家六味地黃丸濃縮丸中莫諾苷、馬錢苷和丹皮酚的溶出行為相似。

表6 六味地黃丸濃縮丸多指標相似因子

3 討論

根據累積溶出度計算公式，累計溶出度理論最大值應為100%。本次試驗計算不同廠家六味地黃丸濃縮丸中莫諾苷、馬錢苷的累積溶出度均存在超過100%，其中莫諾苷達到250%以上。研究[17]表明，當溶液pH=1～4時，莫諾苷、馬錢苷的含量均呈增加趨勢，pH=1～2時，呈明顯增加趨勢。本次試驗選用的溶出介質為pH=1.2，推測酒萸肉中含有多種莫諾苷衍生物在酸性條件下轉化為莫諾苷。此外，在給藥劑量范圍內，莫諾苷衍生物在酸性條件下轉化為莫諾苷，對人體安全無害。

溶出時間的確定。張啟明等[17-18]認為，在酸性介質(pH =1. 0～3. 0)中的最長測定時間建議為2 h，在前期的預實驗中，發現隨著時間的增加，溶出率相應增加，4 h時溶出曲線趨于平穩，6 h溶出率與4h溶出率差值僅為1%。因此，本實驗溶出時間設定為4 h。

本實驗采用f2相似因子法評價不同廠家六味地黃丸指標成分的釋放規律，結果表明，3個指標成分的f2均大于70，說明不同廠家制劑之間釋藥行為相似，但溶出曲線趨勢略有差異，可能與不同廠家在制劑過程中的工藝參數、設備差異有關。

本實驗選擇與胃液酸性接近的pH=1.2的鹽酸-氯化鈉溶液作為溶出介質，參照2015版《中國藥典》六味地黃丸的含量檢測指標考察六味地黃丸濃縮丸的溶出度變化，但在此環境下，酒萸肉中的多種莫諾苷衍生物轉化后為莫諾苷，不能較好地評價莫諾苷的釋放度。因此，建議選擇六味地黃丸中其他具有代表性的、在該環境下穩定的活性成分作為考察指標。