高效液相色譜法同時測定中成藥金蓮清熱膠囊中3種成分

李 琳，曹婭娟，李怡婧，陰 嬌

(寧夏啟元國藥有限公司，寧夏 銀川 750000)

金蓮清熱膠囊是在寧夏啟元國藥有限公司研制的金蓮清熱顆粒的基礎(chǔ)上，改變劑型開發(fā)的中藥新藥。該藥由金蓮花、大青葉、生地黃等組成，通過加水煎煮，過濾，濃縮，干燥，加入適量的輔料制成顆粒后，再灌裝入膠囊制成。其中金蓮花作為金蓮清熱膠囊的君藥之一，其主要指標(biāo)性成分為葒草苷、牡荊苷，具有清熱解毒、抗菌消炎的功效[1-2]；生地黃作為佐藥之一，具有潤燥、清熱生津的功效，其主要指標(biāo)性成分為毛蕊花糖苷[3]。金蓮清熱膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)一直為國家部頒標(biāo)準(zhǔn)(YBZ01712008)，未載入《中國藥典》中，其標(biāo)準(zhǔn)中僅對臣藥知母中的菝葜皂苷元進(jìn)行了含量測定，采用的是薄層雙波長掃描法。該方法不僅用到大量致癌有毒試劑——苯反復(fù)提取，造成檢測效率較低，且含量測定指標(biāo)不能準(zhǔn)確反映臨床療效，因此改進(jìn)含量檢測方法，選擇多種關(guān)鍵藥效成分進(jìn)行定量分析，能夠有效控制金蓮清熱膠囊的質(zhì)量[4]。

1 儀器與試藥

島津LC-20A，包括二元泵，自動進(jìn)樣器，紫外檢測器，Labsolution工作站，電子天平METTLER TOLEDO AG104(101 g～0.1 mg)；KQ-300DE型數(shù)控超聲清洗器：昆山市超聲儀器有限公司。

葒草苷(批號：111777-201302，含量：97.9%)，牡荊苷(批號：111687-201603，含量：95.7%)，毛蕊花糖苷(批號：111530-201512，含量：96.7%)購自中國食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈(均為Guangdong Guanghua Sci-Tech Co.，LTD色譜純)；水為公司自制純化水；其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Welch(月旭)C18(5 μm，4.6 mm×250 mm)；流動相A：乙腈，流動相B：0.2%冰醋酸溶液，線性梯度洗脫，洗脫程序見表1；檢測波長：340 nm；流速：1.0 mL/min；柱溫30 ℃；進(jìn)樣量10 μL。

表1 梯度洗脫程序

2.2 溶液配制

混合對照品溶液配制：取葒草苷對照品、牡荊苷對照品、毛蕊花糖苷對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL各含50 μg的混合溶液，即得。

供試品溶液配制：取金蓮清熱膠囊適量，除去囊殼，內(nèi)容物研細(xì)，精密稱定0.5 g，置具塞錐形瓶中，加入30 mL水，超聲處理(功率250 W，頻率50 kHz)60 min，過濾，取續(xù)濾液20 mL至分液漏斗中，用乙酸乙酯提取3次(30 mL，30 mL，20 mL)，合并乙酸乙酯提取液，水浴80 ℃蒸干，用甲醇轉(zhuǎn)移至10 mL量瓶中，定容，用0.45 μm濾膜過濾，即得。

陰性溶液制備：按處方比例和制法分別制備不含金蓮花、大青葉和地黃的陰性樣品，按供試品溶液的制備方法制備陰性樣品溶液，按照本研究方法測定，并在二極管陣列檢測器上分析色譜峰。結(jié)果表明，方中其他成分不干擾葒草苷、牡荊苷和毛蕊花糖苷的測定。色譜見圖1。

2.3 線性關(guān)系考察

分別精密稱取葒草苷、牡荊苷及毛蕊花糖苷對照品適量，加甲醇稀釋定容，制備混合對照品母液20 mL(紅草苷濃度1.008 mg/mL、牡荊苷濃度0.805 mg/mL、毛蕊花糖苷濃度0.062 mg/mL)。精密量取混合對照品溶液1.0 mL、1.5 mL、2.0 mL、2.5 mL、3.0 mL置于1 0mL容量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。取上述溶液各10 μL注入液相色譜儀中，按照擬定的色譜條件測定，記錄峰面積。計算回歸方程，詳見表2。

注：1.葒草苷；2.牡荊苷；3.毛蕊花糖苷。A.混合對照溶液；B.缺地黃陰性對照溶液；C.缺金蓮花陰性對照溶液；D.供試品溶液。

表2 線性關(guān)系考察結(jié)果

2.4 精密度實驗

取上述混合對照品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，按本研究所用方法測定。以峰面積計算，葒草苷、牡荊苷和毛蕊花糖苷的RSD分別為0.5%、0.8%和0.9%。結(jié)果表明該方法精密度良好。

2.5 重復(fù)性實驗

取同一批樣品(金蓮清熱膠囊，批號：170216)，精密稱定0.5 g左右樣品6份，按照供試品溶液制備方法制成供試品溶液，測定。結(jié)果葒草苷、牡荊苷和毛蕊花糖苷每粒平均含量分別為0.655、0.251、0.081 mg，RSD分別為0.4%、0.5%、1.3%(n=6)，說明本方法重復(fù)性良好。

2.6 加樣回收率實驗

精密稱取已知葒草苷含量的同一批號(含量：0.66 mg/粒)樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入葒草苷對照品溶液(0.208 mg/mL)2 mL，按本研究所用方法測定，計算葒草苷的加樣回收率。精密稱取已知牡荊苷含量的同一批號(含量：0.26 mg/粒)樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入牡荊苷對照品溶液(0.081 mg/mL)2 mL，按本研究所用方法測定，計算葒草苷的加樣回收率。精密稱取已知毛蕊花糖苷含量的同一批號(含量：0.082 mg/粒)樣品6份，每份約0.25 g，精密稱定，分別加入毛蕊花糖苷對照品溶液(0.031 mg/mL)2 mL，按本研究所用方法測定，計算葒草苷的加樣回收率。見表3。

3 討論

3.1 波長選擇

表3 金蓮清熱膠囊中3種成分的加樣回收率測定結(jié)果

將葒草苷、牡荊苷和毛蕊花糖苷的標(biāo)準(zhǔn)品溶液分別在190～400 nm處進(jìn)行掃描，葒草苷最大吸收波長為348 nm，牡荊苷最大吸收波長為337 nm，毛蕊花糖苷最大吸收波長為329 nm，經(jīng)過反復(fù)摸索，最終確定340 nm作為檢測波長，在該波長下，所測各成分分離效果好，分離度達(dá)到要求。

3.2 提取因素考察

本研究對以下提取方法進(jìn)行了考察：甲醇超聲-水飽和正丁醇提取、乙酸乙酯∶70%乙醇=1∶2混合溶液提取、甲醇超聲提取[5]、大孔樹脂吸附-乙酸乙酯提取、乙酸乙酯提取。結(jié)果表明以乙酸乙酯-70%乙醇為提取溶劑，所測得待測成分含量較高，但單用乙酸乙酯提取得到的樣品，雜質(zhì)峰干擾較小且待測成分含量也較高，因此最終采用乙酸乙酯作為提取溶劑。

3.3 流動相的考察

樣品處方中共有7味藥材，成分復(fù)雜，性質(zhì)相近的成分多，流動相先后以等度洗脫方式：甲醇-0.4%磷酸[6]、乙腈-0.4%磷酸、乙腈-0.2%冰醋酸，未能得到良好分離效果，結(jié)合提取方法及色譜條件的考察，最終選擇乙腈-0.2%冰醋酸，梯度洗脫，系統(tǒng)分離效果較好。

本研究建立了金蓮清熱膠囊中多種指標(biāo)成分同時測定的方法，以表征金蓮清熱膠囊的質(zhì)量，多組分同時測定還可以反映復(fù)方中藥的配伍狀況，方法簡單，結(jié)果準(zhǔn)確可靠，適于產(chǎn)品的含量測定及質(zhì)量控制。