脂肪酶催化阿魏酸甘油酯的合成

王艷，薛也，高鵬，羅世雄，竇博鑫，辛嘉英,

1. 哈爾濱商業大學食品科學與工程重點實驗室（哈爾濱 150076）；2. 中國科學院蘭州化學物理研究所羰基合成與選擇氧化國家重點實驗室（蘭州 730000）

阿魏酸是一種天然存在的植物酚酸，具有廣泛的生理活性，可防止中性粒細胞積聚，減小酪氨酸酶活性，降低黑色素生成，還具有抗氧化、清除自由基和預防癌癥的功能[1]。然而，阿魏酸的熔點高，其較弱的親水性和親脂性限制了其在各個方面的應用[2-3]。阿魏酸和甘油的組合可顯著改善其水溶性，而不改變阿魏酸的紫外吸收、抗氧化性和其他功能性質，通過分子改性獲得的阿魏酸衍生物具有抗氧化作用并且具有比阿魏酸更好的物理和化學性質。在醫藥、食品、化妝品等領域具有廣闊的應用前景[4-6]。

化學合成方法大多是基于多重保護和脫保護步驟[7]，由于許多副產物、環境污染嚴重、選擇性差、產品的轉化率低、反應條件嚴格以及通常會破壞天然化合物的結構等問題，不符合國際食品、添加劑的安全性和功能要求，并且在有機系統中，有機溶劑的引入會導致環境污染、反應時間長、轉化率低、副產物的形成和副反應的水解的問題影響酯化反應的效率。脂肪酶是一種可以催化甘油酯的水解以產生甘油，并且能展現顯著的活性[8-10]。因此，試驗研究阿魏酸無溶劑體系的酯交換疏水改性，確立旋轉蒸發儀中脂肪酶催化阿魏酸和甘油反應合成新型抗氧化劑阿魏酸甘油酯的方法，以達到提高阿魏酸的生理活性、擴大阿魏酸的應用范圍、開發用于食品的新功能食品或食品添加劑中的目的[11]。

1 材料與方法

1.1 試驗試劑

阿魏酸（純度＞99%，蘇州暢通化學品有限公司）；DPPH（AR，天津市百世化工有限公司）；二甲基亞砜（AR，天津富宇化學試劑有限公司）；甲醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司）；Novozym 435脂肪酶（酶活10 000 U/g，丹麥諾維信公司）；氯仿（AR，北京化工廠）；丙酮（AR，天津富宇化學試劑有限公司）；苯（AR，天津渤海化工股份有限公司）；無水乙醇（AR，國藥集團化學試劑有限公司）。

1.2 試驗儀器

精密分析天平（SBA224S，Sartorius公司）；電子天平（SBA2202S-CW，上海山岳科學儀器有限公司）；薄層色譜掃描儀（KH-2000，上海添時科學儀器有限公司）；可見分光光度計（722S，上海金梟科學儀器有限公司）；磁力攪拌器（EMS-8C，上海旌派儀器有限公司）；IKA旋轉蒸發儀（RV 10，艾卡儀器設備有限公司）；電熱恒溫鼓風干燥箱（DHG-9053，上海一恒科學儀器有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 反應體系的確定

精確稱取2份5.00 g阿魏酸于圓底燒瓶，加23.94 g甘油，1份溶于10 mL二甲基亞砜中，另1份無溶劑，分別取反應物總質量的10%固定化酶加入上述圓底燒瓶攪拌均勻，置于旋轉蒸發儀中，轉速采用70 r/min，在60 ℃下反應10 h。反應完畢后，用100 mL甲醇分兩次萃取，置于錐形瓶中封口，取0.5 μL樣品，采用薄層色譜檢測進行定量分析。

1.3.2 反應器的確定

以油浴或旋轉蒸發儀（RV 10，IKA）為反應器，圓底燒瓶或磨口三角瓶為反應瓶，分別稱取一定量阿魏酸和甘油置于反應瓶中，混勻后加入反底物總質量的10%的酶開始反應。旋轉蒸發儀的轉速150 r/min，于60 ℃反應10 h。反應完畢后，用100 mL甲醇分2次萃取，合并萃取液后置于錐形瓶中密封保存，取0.5 μL的萃取液，進行薄層色譜分析

1.3.3 展開劑的選擇

將硅膠板放入電熱恒溫鼓風干燥箱活化1 h，取出后靜置至室溫，稱取0.1 g阿魏酸于試管中，用10 mL甲醇溶解，用量筒量取40 mL不同種類的展開劑（1，2，3，4和5）倒入展開缸中，用微量進樣器取0.5 μL阿魏酸樣液，滴在硅膠板上作為對照點，用甲醇潤洗微量進樣器1～2次，另取0.5 μL阿魏酸甘油酯樣液，滴在硅膠板上與對照點等高間距2～3 cm處。將硅膠板放入展開缸中，30 min后取出靜置，在紫外光照射下觀察。展開劑種類及比例見表1。

表1 展開劑的種類及比例

1.3.4 單因素試驗

稱取5.00 g阿魏酸置于圓底燒瓶，加23.94 g甘油，取定量固定化酶加入上述圓底燒瓶攪拌均勻，置于旋轉蒸發儀中，轉速50～90 r/min，反應一段時間。反應完畢后，用100 mL甲醇分兩次萃取，置于錐形瓶中封口，取0.5 μL樣品，采用薄層色譜檢測進行定量分析。采用單因素試驗（因素水平設計見表2），考察溫度、時間、酶用量、轉速對阿魏酸轉化率的影響以輔助確定較好的試驗點。

表2 單因素試驗因素水平表

1.3.5 正交試驗

采用正交試驗考察各因素對阿魏酸轉化率的影響。因素水平設計見表3。

表3 正交試驗因素水平表

選擇旋轉蒸發儀，反應器轉速設定為70 r/min，采用無溶劑體系，按L9(34)正交表進行試驗，如表4所示。

表4 L9(34)正交表

1.3.6 薄層色譜檢測

采用薄層色譜技術對樣品液進行檢測，先將硅膠板放入電熱恒溫鼓風干燥箱活化1 h，取出后靜置至室溫，準確稱取0.1 g阿魏酸放入試管中，加入10 mL甲醇溶解，將其作為對照組，按最優展開劑及其比例量取40 mL展開劑于展開缸中，用微量進樣器取0.5 μL阿魏酸樣液，滴在硅膠板上作為對照點，用甲醇潤洗微量進樣器1～2次，取0.5 μL阿魏酸甘油酯樣液，滴在硅膠板上與對照點等高間距2～3 cm處。將硅膠板放入展開缸中，30 min后取出靜置，在薄層色譜掃描儀下測定得到阿魏酸標樣與產物峰面積比S1/S2，根據式（1）和（2）計算出轉化率（α）。

式中：S1/S2為阿魏酸標樣與產物峰面積比；C1為阿魏酸樣液濃度；Cx為阿魏酸甘油酯樣液濃度；V為樣液滴加量；M為阿魏酸甘油酯的相對分子質量；m標為反應中阿魏酸的添加量。

1.3.7 清除DPPH自由基能力檢測

一組取分別為0，0.312 5，0.625 0，1.250 0，2.500 0和5.000 0 mL的阿魏酸樣液，另一組去同等體積的阿魏酸甘油酯產物，全部定容至10 mL及配制濃度6×10-5mol/L的DPPH溶液。取12個10 mL試管，向試管中加3.5 mL DPPH溶液，分別向試管中加0.5 mL不同濃度的樣液，搖勻，放置于暗處反應30 min。以乙醇溶液作為空白，使用可見分光光度計在517 nm處分別測定樣品液與DPPH溶液混合后溶液的吸光度Ai，樣品液與乙醇混合后溶液的吸光度Aj，DPPH溶液與乙醇混合后的溶液吸光度A0。并根據式（3）計算抑制率[12]。

2 結果與分析

2.1 反應體系及反應器選擇的結果分析

在合成阿魏酸甘油酯的研究中，考慮通過反應體系的構建和反應器的選擇實現副產物乙醇的及時去除，并篩選出對脂肪酶活性抑制較小且底物混溶程度較好的有機溶劑。無論是有機溶劑體系還是無溶劑體系，在旋轉蒸發儀中的酶催化活性較好，這主要由于旋轉蒸發儀可以去除副產物乙醇，避免其對酶活性的抑制作用和促進反應向正反應方向進行。由于阿魏酸和甘油在有機溶劑中的溶解度較差，因此，在旋轉蒸發儀中無溶劑體系下固定化脂肪酶Novozyme 435催化阿魏酸的轉化率最高，為85.30%，如表5所示。

表5 反應體系及反應器構建結果

2.2 展開劑及其比例的選擇

薄層色譜法是一種吸附薄層色譜分離法，利用阿魏酸及阿魏酸甘油酯的極性大小不同[13]，極性大小不同使得兩種物質分離，通過觀察在紫外光照射下兩種物質的距離確定展開劑的效果，在薄層色譜掃描儀下測定得到峰面積比，進而計算阿魏酸轉化率，結果見表6及圖1。

由表6和圖1可知，為得到準確的試驗數據，薄層色譜檢測中展開劑應選用三氯甲烷-苯-甲醇-乙酸，展開劑比例為32∶20∶1.5∶1。

2.3 基本反應條件對轉化率的影響

在旋轉蒸發儀中無溶劑體系下利用固定化脂肪酶催化阿魏酸和甘油合成阿魏酸甘油酯的反應過程中，反應時間、反應溫度、反應器轉速及酶用量均會對反應造成一定影響。由圖2和表7可知，反應時間和反應器轉速對其影響最為顯著，其次是反應溫度和酶用量。轉速150 r/min時基本可以排除傳質的限制和有效去除副產物乙醇對反應的影響。最佳反應時間為10 h，這說明反應進行到10 h后基本達到平衡，因此再延長時間轉化率也不會有明顯升高。適宜的反應溫度對酶催化活性的發揮和傳質有利，從結果可知最佳反應溫度為60 ℃，此時其轉化率最高。酶促反應過程中，酶用量是影響經濟效益的主要因素，從試驗結果可以看出，酶用量超過10%時，轉化率基本維持不變，說明此時酶活性中心已經飽和，過多的酶只能在一定范圍內縮短達到反應平衡的時間，并不能改變其轉化率，因此最佳酶用量為10%。由表7可知，最佳的工藝條件為：溫度60 ℃，酶用量10%，反應時間10 h，轉速150 r/min。在此條件下阿魏酸的轉化率最高，為85.30%。2.4 清除DPPH自由基能力的結果與分析

DPPH是一種比較穩定的自由基，而且它的使用最為廣泛，常用來評價物質的抗氧化能力[14-15]。試驗中，采用不同濃度阿魏酸樣液及阿魏酸甘油酯來測定對DPPH自由基清除能力，根據抑制率來判斷其抗氧化能力。由表9和表10可知，阿魏酸抑制率最大為84.70%，阿魏酸甘油酯抑制率最大為85.60%，阿魏酸甘油酯清除能力強于阿魏酸。從分子結構的角度考慮，推測阿魏酸甘油酯可能是因為含有酚羥基，具有很強的給氧能力，從而增大清除自由基能力。

表6 不同展開劑的結果

圖1 不同展開劑的結果

圖2 基本反應條件對Novozyme 435催化阿魏酸甘油酯合成的影響

表7 正交試驗結果

表8 方差分析表

表9 不同濃度阿魏酸的抑制率

表10 不同濃度阿魏酸甘油酯的抑制率

3 結論

試驗采用在無溶劑體系下通過旋轉蒸發儀使用脂肪酶催化阿魏酸與甘油合成阿魏酸甘油酯的方法，并優化催化過程中條件。合成后阿魏酸甘油酯對DPPH自由基有一定清除作用，且清除能力強于阿魏酸。從分子結構角度考慮，推測阿魏酸甘油酯可能是因為含有酚羥基，具有很強的給氧能力，使其呈現強抗氧化性和清除自由基能力，有望將該方法合成的阿魏酸甘油酯更好運用于食品、食品添加劑中。