ε-聚賴氨酸豌豆蛋白抗菌膜制備及其性能

郭永

黃河水利職業(yè)技術(shù)學(xué)院環(huán)境工程學(xué)院（開封 475003）

豌豆蛋白是一種優(yōu)質(zhì)的植物蛋白，它營養(yǎng)豐富、來源廣泛、價(jià)格低廉而且不含植物激素和致敏源[1]，利用豌豆蛋白較好的成膜性制備的蛋白膜，能夠作為接觸包裝材料用于食品保鮮或直接食用，并且具有可生物降解性，能有效地解決塑料包裝廢棄物污染環(huán)境的問題，是將來食品包裝領(lǐng)域理想的新型材料[2]。但可食性膜因本身營養(yǎng)豐富，易受微生物污染，故可通過向膜中加入抑菌劑保證食品的品質(zhì)。目前，安全、高效、穩(wěn)定的可食性抑菌膜已經(jīng)成為食品工業(yè)研究的熱點(diǎn)。

ε-聚賴氨酸（ε-poly-L-lysine，ε-PL）作為新型天然防腐劑，具有很好的殺菌能力和熱穩(wěn)定性，日益受到食品保鮮應(yīng)用領(lǐng)域的重視[3-4]。ε-PL由一類白色鏈霉菌（Streptomyces albulus）代謝產(chǎn)生，是一種具有廣譜抑菌性的多肽，由25～35個(gè)L-賴氨酸殘基組成，ε-PL能在人體內(nèi)分解為賴氨酸，因此又是一種營養(yǎng)型抑菌劑，安全性高于其他化學(xué)防腐劑[5-6]。ε-PL由日本學(xué)者20世紀(jì)80年代初次發(fā)現(xiàn)，目前已發(fā)展比較成熟，在我國剛剛起步。近年來，國內(nèi)文獻(xiàn)報(bào)道中利用ε-PL添加到抑菌膜較多，基質(zhì)以殼聚糖、海藻酸鈉、阿拉伯膠、豌豆淀粉等多糖類為主[7-9]，蛋白類膜主要利用大豆分離蛋白作基質(zhì)研究[10]，但鮮見ε-聚賴氨酸在豌豆蛋白可食性膜的應(yīng)用研究。

此次試驗(yàn)以豌豆為原料，經(jīng)堿溶酸沉法得到豌豆分離蛋白，采用單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)確定制備豌豆蛋白膜的最佳工藝參數(shù)，最終得到機(jī)械性能較好的豌豆蛋白膜，在其中添加抑菌性良好的ε-聚賴氨酸（ε-PL）制備抑菌蛋白膜，并研究ε-聚賴氨酸對(duì)蛋白膜理化性能的影響，為ε-PL抗菌膜的實(shí)際應(yīng)用提供理論依據(jù)。

1 試驗(yàn)材料與試劑

豌豆（市售）；ε-聚賴氨酸（甘油酯制劑，鄭州拜納佛生物工程股份有限公司）；正己烷（沈陽化學(xué)試劑廠）；甘油（國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）；蜂蠟（河北東光縣瑞豐蠟業(yè)有限公司）。

2 主要試驗(yàn)儀器與設(shè)備

HH-6電熱恒溫水浴鍋（常州國華電器有限公司）；PHS-3C型精密pH計(jì)（上海理達(dá)儀器廠）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；FD-5型真空冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康技術(shù)公司）；正方形玻璃板（自制）；螺旋測微器（蘇州量子儀器有限公司）。

3 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

3.1 脫脂豌豆粕的制備

取適量豌豆置于玻璃器皿，在40 ℃下在電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱中烘干至恒質(zhì)量[11]。再用高速多功能粉碎機(jī)研磨成粉，將磨好的豌豆粉與正己烷按1∶8（g/mL）比例混合，使正己烷和豌豆粉充分混勻，靜置于通風(fēng)櫥內(nèi)24 h，生成豌豆粉正己烷浸提液，然后用布氏抽濾器處理，得到低變性脫脂豌豆粕，備用，同時(shí)利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀回收正己烷。

3.2 豌豆分離蛋白的提取

參照Stone等[12]堿溶酸沉的方法提取豌豆分離蛋白。利用堿溶酸沉法提取豌豆分離蛋白。將脫脂豌豆粕按1∶20（g/mL）溶于蒸餾水，配制成一定濃度溶液，用1.0 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH至8.0，冷卻至室溫后在4 ℃下，以10 000 r/min離心30 min；取上清液，用1.0 mol/L HCl調(diào)pH至4.5，以10 000 r/min離心30 min。取沉淀，即得到豌豆分離蛋白（PPI），冷凍干燥，備用。

3.3 豌豆蛋白抑菌膜的制備

以膜的抗拉伸強(qiáng)度為考察指標(biāo)，確定單因素豌豆蛋白濃度、pH、甘油添加量、蜂蠟、加熱溫度及加熱時(shí)間對(duì)豌豆蛋白膜機(jī)械性能的影響。在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，采用正交試驗(yàn)，確定最佳抗拉伸強(qiáng)度豌豆蛋白抑菌膜制備優(yōu)化工藝條件。配制7.0%豌豆分離蛋膜液，調(diào)節(jié)成膜液pH至9.0，于90 ℃水浴30 min，得到成膜液。加入不同濃度的ε-聚賴氨酸，混勻后攪拌30 min，加入3 g/L蜂蠟、1%甘油。過濾后，脫氣除去表面氣泡。將50 mL濾液涂布于自制的玻璃板上，在60℃干燥4 h后揭膜，即得到豌豆蛋白抑菌膜，并在35℃和RH 55%的環(huán)境中平衡48 h，分別對(duì)膜進(jìn)行物理功能和抑菌測定。

4 試驗(yàn)分析方法

4.1 膜厚度的測定

膜厚度參照GB/T 6672—2001《塑料薄膜和薄片厚度機(jī)械測量法》[13]，使用螺旋測微器在膜上隨機(jī)選取10個(gè)點(diǎn)并計(jì)算其平均值。

4.2 機(jī)械性能的測定

機(jī)械性能參照GB/T 1041.1—2018/ISO 527-1：2012《塑料拉伸性能的測定》[14]，每個(gè)樣品測定3次，求平均值。

4.3 水蒸氣透過率的測定

水蒸氣透過率（Water vapor transmission rate of pea protein membrane，WVP）參照GB 1037—1988進(jìn)行測定[15]。

4.4 蛋白膜水溶性的測定

蛋白膜水溶性參照Peng等[16]的方法并稍作改進(jìn)。將膜樣品裁成20 mm×20 mm的正方形，烘干至恒質(zhì)量，放入含有30 mL蒸餾水的100 mL錐形瓶中，在25℃恒溫振蕩箱中處理24 h，將不溶性膜樣品取出干燥至恒質(zhì)量。每個(gè)樣品測定3次，求平均值。按式（1）計(jì)算膜的水溶性。

式中：m1為初始質(zhì)量，g；m2為24 h后干燥平衡后的剩余質(zhì)量，g。

式中：m1為初始質(zhì)量，g；m3為浸泡后的膜樣品的質(zhì)量，g。

5 結(jié)果與分析

5.1 ε-聚賴氨酸添加量對(duì)豌豆蛋白膜厚度的影響

由表1可知，未添加抑菌物質(zhì)的對(duì)照膜厚度為200.55 μm。隨著ε-聚賴氨酸添加量的增加，膜的厚度有增加趨勢(shì)，當(dāng)ε-聚賴氨酸添加量達(dá)0.3%時(shí)，膜的厚度增加并不顯著（p＞0.05）。可能是ε-聚賴氨酸的添加增加了蛋白膜中的干物質(zhì)含量，而且ε-聚賴氨酸中的部分ɑ-氨基與蛋白質(zhì)間的相互作用可能會(huì)在一定程度上改變膜的結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致膜的厚度有所增加，但不顯著。

表1 ε-聚賴氨酸對(duì)豌豆蛋白膜厚度的影響

5.2 ε-聚賴氨酸添加量對(duì)豌豆蛋白膜機(jī)械性能的影響

由表2可知，對(duì)照膜的抗拉伸強(qiáng)度為4.51 MPa，斷裂伸長率為128.48%。當(dāng)ε-聚賴氨酸的添加量為0.5%時(shí)，蛋白膜的抗拉伸強(qiáng)度顯著提高（p＜0.05），比對(duì)照提高50.1%，斷裂伸長率提高17.3%。可能由于ε-聚賴氨酸的膠體網(wǎng)絡(luò)交聯(lián)性質(zhì)[17]，ε-聚賴氨酸分子上的部分ɑ-氨基與豌豆蛋白質(zhì)羧基分子間的相互作用，電荷重新分布，形成的肽鍵使膜內(nèi)分子結(jié)合更加緊密，導(dǎo)致膜的抗拉伸強(qiáng)度和斷裂伸長率提高。

5.3 ε-聚賴氨酸添加量對(duì)豌豆蛋白膜水蒸氣透過率的影響

由表3可知，當(dāng)ε-聚賴氨酸添加量為0.5%時(shí)，隨著添加量的增加，膜的WVP比對(duì)照降低了35%，這可能是ε-聚賴氨酸與豌豆蛋白分子形成肽鍵，以及蜂蠟疏水基與蛋白質(zhì)疏水基相互作用[18]，使膠體網(wǎng)絡(luò)緊密，降低了水蒸氣的透過性。WVP顯著降低，增強(qiáng)了抑菌膜的阻隔性，使其阻水性和隔氧性的實(shí)際應(yīng)用效果更好。

表2 ε-聚賴氨酸對(duì)豌豆蛋白膜機(jī)械性能的影響

表3 ε-聚賴氨酸對(duì)豌豆蛋白膜水蒸氣透過率的影響

5.4 ε-聚賴氨酸添加量對(duì)豌豆蛋白膜水溶性的影響

由表4可知，隨著ε-聚賴氨酸添加量的增加，蛋白膜的溶解度和溶脹指數(shù)分別降低了22.3%和34.0%。當(dāng)ε-聚賴氨酸的添加量為0.7%時(shí)，蛋白膜的溶解度和溶脹指數(shù)最小（p＜0.05）。可能是ε-PL弱極性分子與豌豆蛋白分子相互作用，形成的膜分子間結(jié)合更加緊密，減少了聚合物基質(zhì)的自由體積，降低了蛋白膜水溶性。

表4 ε-聚賴氨酸對(duì)豌豆蛋白膜水溶性的影響

5.5 ε-聚賴氨酸添加量對(duì)豌豆蛋白膜抑菌性的影響

從表5可看出，當(dāng)ε-聚賴氨酸的添加量不超過0.5%時(shí)，蛋白膜對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌沒有抑制作用；當(dāng)ε-聚賴氨酸的添加量達(dá)到0.5%時(shí)，蛋白膜對(duì)兩種菌株均有抑制作用，且隨著ε-聚賴氨酸添加量的增加，抑菌圈直徑顯著增大（p＜0.05）。這可能是ε-聚賴氨酸呈高聚合多價(jià)陽離子態(tài)，具有表面活性劑作用，破壞了細(xì)菌的細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)，引起細(xì)胞物質(zhì)、能量和信息中斷，從而導(dǎo)致細(xì)胞死亡，故發(fā)揮抑菌作用[19]。考慮到應(yīng)用的經(jīng)濟(jì)性，選擇0.5%即可達(dá)到良好的抑菌效果。

表5 ε-聚賴氨酸對(duì)豌豆蛋白膜抑菌性的影響

6 結(jié)論

以豌豆蛋白為基質(zhì)的成膜液中添加0.5%的ε-聚賴氨酸抑菌劑，所制備的抑菌膜不僅對(duì)大腸桿菌和金黃色葡萄球菌產(chǎn)生明顯的抑菌作用，而且由于自身的交聯(lián)性，膜的結(jié)構(gòu)更加緊密，提高了豌豆蛋白膜抗拉強(qiáng)度和韌性，降低了水蒸氣透過性和水溶性，總體改善了豌豆蛋白膜的物理性能，安全而環(huán)保，因此，在食品保鮮領(lǐng)域應(yīng)用前景廣闊。