堿性蛋白酶酶解荷葉蛋白制備多肽的工藝

李偉民，周海燕，鄭麗娟，余小娜，魏泉增

1. 許昌學院食品與生物工程學院，河南省食品安全生物標識快檢技術重點實驗室（許昌 461000）；2. 鄢陵縣市場監督管理局（許昌 461200）

荷葉是一種有根莖的水生植物，屬睡蓮科。荷葉在中國許多地區均有種植，如浙江、江蘇、湖南等地[1]。荷葉資源的利用主要針對荷葉中含有大量的維生素C和原荷葉堿、荷葉堿等多種生物堿[2]。這些物質可用于治療燥熱渴悶、暑濕泄瀉、便血崩漏[3]等癥狀，還具有保肝護肝[4]、消炎[5]等功效。荷葉中同時還含有豐富的蛋白質[6]，為更好地利用荷葉蛋白資源，酶解制備多肽工藝十分必要。

蛋白經過蛋白酶酶解后，得到的多肽與相應的蛋白相比，更加容易通過小腸黏膜被機體吸收[7]，從而具有更高的營養價值[8]。多肽由2～16個氨基酸組成[9]，具有多種生物活性，如抑菌性[10]、免疫性[11]、和抗氧化性[12]等方面。

大多數制備多肽的工藝都是以大豆、大米等糧食作物為原料。隨著全球人口數量日益增多，對食物的需求量也逐漸增大，大米、玉米、小麥等主要糧食作物的進口量都在成倍增長[13]。對新型蛋白質資源的開發利用具有廣闊前景。荷葉干粉中的蛋白質含量達22.9%[14]，對荷葉蛋白資源的進一步開發利用，具有重要的研究意義。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

荷葉粉；堿性蛋白酶（酶活力20萬 U/g，天津市諾奧科技發展有限公司）；其他試劑（均為國產分析純）。

1.2 儀器與設備

FA2014B分析天平（上海佑科儀器儀表有限公司）；TDL-60B離心機（上海安亭科學儀器廠）；T6可見分光光度計（北京普析通用儀器有限責任公司）；Dk-8D水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；PHS-3C型pH計（上海佑科儀器儀表有限公司）；DL-1型電爐（中興偉業儀器有限公司）；750t型粉碎機（鶴壁市天冠儀器儀表有限公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 酶解工藝

準確稱取一定量的荷葉粉與反應容器中，依照蛋白酶添加量加入堿性蛋白酶溶液，調整到預設pH，緩慢攪拌，酶解過程中注意維持酶解系統pH恒定。酶解結束后將酶液迅速置于沸水中滅酶10 min。冷卻至室溫后以4 000 r/min離心10 min，收集上清液。

1.3.2 標準曲線的繪制

多肽含量測定方法采用雙縮脲法[15]。準確稱量1.000 g酪蛋白，用30 mL 10% NaOH溶液溶解，溶解后，用蒸餾水定容至100 mL，得到10 mg/mL酪蛋白標準溶液。分別在6支試管中加入0，0.1，0.3，0.5，0.7和0.9 mL酪蛋白標準液，用蒸餾水補齊至1.0 mL，分別加入4 mL雙縮脲試劑于6支試管中，充分混合均勻，在室溫下反應30 min，在540 nm處比色測定。

1.3.3 多肽濃度測定

將收集到的上清液定容至100 mL，搖勻移取溶液10 mL至離心管中，以4 000 r/min離心5 min，使上清液澄清，吸取上清液1 mL，并和4 mL雙縮脲試劑混合，以蒸餾水為空白，室溫下溶液反應30 min，測定吸光度。根據標準曲線關系式，計算溶液濃度。

1.3.4 單因素試驗

確定堿性蛋白酶添加量（1 000，1 500，2 000，2 500和3 000 U/g），酶解溫度（40，45，50，55和60 ℃），酶解時間（2，3，4，5和6 h），酶解pH（7.0，8.0，9.0，10.0和11.0）4個因素，分別對溶液中多肽含量的影響。

1.3.5 響應面試驗

在單因素試驗結果探索最適酶解時間、最適酶解pH、最適酶解溫度、最適堿性蛋白添加量的基礎上，選取其中的酶解時間、酶解pH、酶解溫度作響應面綜合分析。采用Design-Expert 8.0.6軟件中心組合試驗進行多肽含量提取最佳工藝。試驗方案見表1。

表1 試驗因素和水平

2 結果與分析

2.1 酪蛋白標準曲線

以酪蛋白含量為橫坐標，吸光度作為縱坐標，酪蛋白標準曲線如圖1所示?；貧w方程為：y=0.043 5x+0.000 9，R2=0.999 9。

圖1 蛋白標準曲線

2.2 單因素試驗

2.2.1 堿性蛋白酶添加量對酶解效果的影響

堿性蛋白酶添加量對酶解液中多肽含量的影響如圖2所示。隨著蛋白酶添加量的增加，溶液中多肽含量呈現先增加后下降的趨勢。酶添加量1 000 U/g的條件下多肽含量最低，隨著蛋白酶添加量增加，水解度不斷增大。堿性蛋白酶添加量2 000 U/g時，多肽含量最高，隨著蛋白酶量繼續增加，多肽含量降低。當酶濃度過高時，酶分子間可能相互水解，導致酶解效果下降[16]。也可能由于蛋白質的過度水解破壞了肽鍵，產生氨基酸，使多肽的含量減少。

2.2.2 酶解時間對酶解液中多肽含量的影響

酶解時間對酶解效果的影響如圖3所示。荷葉多肽的含量呈現出先上升后下降趨勢，酶解2 h條件下多肽含量最低，隨著時間的增加，荷葉多肽含量隨之增加。荷葉在酶解時間5 h時多肽含量最大。隨著酶解時間繼續增加，荷葉多肽含量下降，酶解時間6 h時，酶解液中多肽含量最低，這可能是由于隨著酶解時間的延長，酶濃度逐漸減小，活性逐漸下降，最終失活。酶解最適時間為5 h。

圖2 堿性蛋白酶添加量對荷葉多肽含量的影響

圖3 酶解時間對荷葉多肽含量的影響

2.2.3 溫度對酶解液中多肽含量的影響

溫度對酶解液中多肽含量的影響如圖4所示。溫度從40 ℃升至60 ℃過程中，荷葉多肽得率呈現出先上升后下降趨勢。在40 ℃條件下荷葉多肽的含量最低，溫度升至55 ℃時荷葉多肽的得率達到最大值。繼續升高溫度，多肽含量反而下降。溫度偏高或偏低會抑制堿性蛋白酶的活性，溫度過高會導致堿性蛋白酶逐漸失活，影響酶解效果，堿性蛋白酶酶解荷葉蛋白的最適溫度在55 ℃。

圖4 酶解溫度對荷葉多肽含量的影響

2.2.4 酶解pH對酶解液中多肽含量的影響

酶解pH對酶解液中多肽含量的影響如圖5所示。在pH 7.0～11.0過程中，荷葉多肽的得率呈現出先增加后減小趨勢。pH 7.0時荷葉多肽的含量最低。pH 9.0時，荷葉多肽的得率達到最大值。隨著pH繼續增大，由于環境條件的pH超過酶的最適pH，限制酶的活性，所以酶解液中的多肽含量也隨之下降。堿性蛋白酶酶解荷葉蛋白的最適pH為9.0。

圖5 酶解pH對荷葉多肽含量的影響

2.3 響應面法優化

2.3.1 響應面法試驗分析及結果

從4個單因素結果中選取酶解時間（A）、酶解pH（B）、酶解溫度（C）這3個因素作為參考依據，以多肽含量為指標。進行響應面試驗，確定堿性蛋白酶水解制備荷葉多肽的最佳工藝條件。響應面試驗方案及結果見表2。

表2 響應面試驗設計及結果

2.3.2 方差分析

通過Design-Expert 8.0.6軟件進行數據分析，建立多元二次響應面回歸模型為：R=13.15-0.069A-0.13B-0.015C-0.046AB+0.031AC-0.061BC-0.29A2-0.29B2-0.27C2。由表3可以看出模型達到極顯著（p＜0.01），失擬項不顯著（p＞0.05），表明方程無失擬性因素存在，回歸模型與實際值能較好的擬合。一次項A、B表現為極顯著，二次項A2、B2、C2表現為極顯著，說明他們對響應值影響極大。由F檢驗可以得到影響因素主次排序為：酶解pH（B）、酶解時間（A）和酶解溫度（C）。

表3 回歸分析結果

圖6直觀反映不同兩因素之間的交互作用對多肽含量的影響，曲面越彎曲，兩因素交互作用對多肽含量的影響越顯著[17]。由表4可知，其中因素BC對酶解效果影響極顯著（p＜0.01），AB對酶解效果影響顯著（p＜0.05），AC對多肽含量的影響不顯著（p＞0.05）。

圖6 不同兩因素之間交互作用對酶解液中多肽含量的影響

2.4 荷葉蛋白酶解工藝的確定及優化工藝條件驗證

經Box-Behnken試驗設計，Design-Expert 8.0.6軟件分析得出最優條件為：酶解pH 8.78，酶解時間4.9 h，酶解溫度54.9 ℃。此條件下酶解液中多肽含量為13.164 8 mg/mL。將工藝參數調整為：酶解時間4.9 h，酶解溫度54.9 ℃，酶解pH 8.78。在此工藝測定的多肽含量為13.158 6 mg/mL。與理論條件下的多肽含量較為接近。試驗可以證明模型可靠，方程能夠比較真實地反映各因素對多肽含量影響的實際情況。通過軟件建造的模型也能真實直觀地反映情況，模型與實際情況貼近吻合，響應面的數據處理真實有效。

3 結論

荷葉中蛋白質的含量較高，并且荷葉價格低廉。通過酶解的方法制備荷葉多肽，條件溫和，無化學試劑殘留，對人體無害。試驗探討了在單因素基礎上，進行響應面試驗對荷葉蛋白酶解工藝進行優化，荷葉多肽制備的最優條件為：加酶量2 000 U/g，酶解pH 8.78，酶解溫度54.9 ℃，酶解時間4.9 h。在此條件下，測得溶液中多肽的含量最高，與預測值兩者之間相對誤差為0.05%。為利用中國荷葉蛋白資源，提高荷葉附加值提供基礎。