野生大樹茶種質資源的品質指標多樣性分析評鑒

劉亞兵，趙華富，喬大河，陳娟，陳翔，曹雨*

1. 貴州省農業科學院茶葉研究所（貴陽 550006）；2. 習水仙緣紅有限公司（習水 564600）

大樹茶（學名：Camellia arborescens Chang et Yu）是經過長期的自然選擇和人文環境選擇下來的結果，主要分布在中國西南地區，具有良好的環境適應性、優良的茶葉品質及深厚的歷史文化底蘊[1-2]。以大樹茶為原料，加工后的茶葉給人們帶來很多生理和保健益處，如止渴、消除疲勞、利尿解毒、防止齲齒等作用[3-4]。

貴州位于中國的西南地區，處于茶樹的起源中心地帶，境內分布著大量的茶組植物資源，但是因為長期以來經濟發展的落后以及可利用土地資源的短缺，對這些豐富茶組植物資源的利用有限。但是，這些尚未開發的茶樹資源為研究其遺傳多樣性、群體結構以及進化關系提供寶貴的資源[5]。特別是習水大樹茶種質資源，在歷史文化、經濟、科研均具有較高價值，是貴州北部分布較廣的、較原始的一個原生種，與茶樹（Camellia sinensis）在分類學上同屬一個組中不同的種[6]。多以半野生型和栽培型大樹茶形式生長于我省北部山區，大樹茶群落目前總體生長良好，當地農民采摘大樹茶原料收獲頗豐的經濟效益，表現出極大的經濟價值和開發潛力。近年來，有研究者對大樹茶資源類型、地理位置分布、管理方式及生態環境進行描述，并對其水浸出物、茶多酚、氨基酸、咖啡堿等茶葉內合成分及兒茶素組分進行檢測與分析[7]。也有研究者[8]對大樹茶資源遺傳多樣性進行調查研究，因為大樹茶資源長期缺乏人工馴化，其遺傳多樣性要高于人工馴化的栽培型。但是，對其應用還停留在初放的種質混制階段，而針對種質個體特異性系統及加工后品質指標多樣性評價研究還處于初步階段[9]。

為加快大樹茶資源的開發利用，試驗通過收集習水的20份大樹茶單株，分別測定其6個品質指標：水分、游離氨基酸總量、茶多酚、咖啡堿、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）及兒茶素總量，應用相關性分析、主成分分析、逐步回歸分析方法建立加工茶葉綜合評價指標的回歸模型，探究模型擬合度及回歸模型顯著性，通過聚類分析法對20份大茶樹單株進行差異性分析和多樣性分析，對品質進行初步劃分，分析單株差異對生化成分的影響，從而對品質進行評價，篩選出3個AAA級大茶樹單株。所建模型可應用于實際大茶樹品質評價，為篩選具有高品質的大茶樹提供參考和借鑒，為中國茶產業的發展提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

采集原生于習水縣境內的習水大樹茶鮮葉（以單株作為鮮葉供給主體，形成單株制樣；選取單株為對比個體，性狀穩定；以一芽二葉或同等嫩度的對夾葉鮮葉為主，占比不小于95%）及其鮮葉原料制成的茶葉產品。

1.2 方法

1.2.1 樣品處理

鮮葉→攤青（6 h）→殺青（230 ℃，3～4 min）→干燥（烘箱，85 ℃）→生化成分測定

1.2.2 品質指標測定方法

水分參照GB 5009.3—2016干燥法測定；游離氨基酸總量參照GB/T 8314—2013茚三酮比色法測定；茶多酚參照GB/T 8313—2018酒石酸亞鐵比色法測定；咖啡堿參照GB/T 8313—2018紫外分光光度法測定；EGCG及兒茶素參照GB/T 8313—2018高效液相色譜法測定。

1.2.3 試驗設計

選擇習水境內不同大樹茶單株的一芽二葉或同等嫩度的鮮葉為原料，經過綠茶制作工藝，經過攤涼、殺青后，直接烘干形成目標樣品[10]，處理后測定其水分、游離氨基酸總量、茶多酚、咖啡堿、EGCG及兒茶素總量等品質指標，對所得試驗數據進行相關性分析、主成分分析、逐步回歸分析方法建立大樹茶綜合評價指標的回歸模型[11]，選擇擬合度較高、回歸模型顯著的品種。通過聚類法對20份單株品質進行初步劃分，通過分析選擇綜合評分較高的3份單株作為AAA單株。

將水分定為100分，將其權重系數設為20；游離氨基酸總量越高越好，定為100分，設其權重系數設為15；茶多酚越小越好，茶多酚定為100分，設其權重系數設為20；咖啡堿值越小越好，定為100分，設其權重系數設為15；EGCG含量定為100分，設其權重系數設為15；兒茶素定為100分，設其權重系數設為15。

1.2.4 數據分析

采用SPSS 19.0 統計軟件進行單因素方差分析（One-Way ANOVA），主持成分分析；采用Origin Pro 9.0進行聚類法。

2 結果與分析

2.1 不同品種大樹茶品質的分析

由表1和表2可以看出，不同品種大樹茶的品質成分含量差異明顯，其中水分最高是品種2017-15，為10.58%，最低是品種2017-6，為6.69%；品種2017-3的茶多酚含量最高，為27.48%，最低是品種2017-7，為18.64%；游離氨基酸總含量最高是品種2017-5，為4.79%，最低是品種2017-9，為1.56%；咖啡堿含量最高是品種2017-13，為5.51%，最低是品種2017-6，為2.6%；EGCG含量最高是品種2017-3，為11.41%，最低是品種2017-12，為5.45%；兒茶素總含量最高是品種2017-6，為17.62%，最低是品種2017-7，為11.78%。因此，不同品種大樹茶各品質差異明顯。

將不同大樹茶品種按1.2.1所示的加工流程制作成品茶。測定并分析不同品種特征指標，結果如表2所示。不同品種的最值差距明顯，方差相對較高，表明不同大樹茶加工的品質存在較大差異，不同品種各項品質指標影響方向不一致。

表1 不同大樹茶單株的生化指標

表2 不同大樹茶單株品質的描述分析

2.2 不同大樹茶單株品質指標的主成分分析

通過SPSS軟件對20份大樹茶單株的6個指標進行相關分析，結果見表3。通過相關分析表明，水分與茶多酚及兒茶素含量存在極顯著的負相關，與咖啡堿含量存在正相關；游離氨基酸總含量與咖啡堿含量存在極顯著正相關；茶多酚含量與EGCG含量、兒茶素含量存在極顯著正相關；EGCG與兒茶素存在極顯著正相關。由于各指標間相關關系的存在，易造成整體信息發生重疊，因此，有必要選取具有代表性的評價指標，消除變量之間相關性，降低評價負擔。

為進一步討論不同品種大樹茶品質的貢獻程度，采用因子分析和主成分分析法確定影響的主要因素[13]，為評價大樹茶品質提供依據。對6個指標進行主成分分析，得出評價因子特征值和累計貢獻率，如表4所示。由于前2個主成分對應特征值均大于1，對應的累計方差貢獻率為91.428%，故可選取前2個主成分，能較全面反映出不同大樹茶品質的主要信息。

表3 不同大樹茶單株品質的相關性 %

表4 評價因子的特征值和累計貢獻率

2.3 主成分載荷矩陣、載荷圖及特征向量

主成分載荷反映了各指標對主成分的貢獻率的大小[14]，其前2個主成分載荷矩陣見表5，由表5可知，第一主成分F1主要反映茶多酚（X3）、EGCG含量（X5）、兒茶素總量（X6）；第二主成分F2反映游離氨基酸總量（X2）、咖啡堿含量（X4）和EGCG含量（X5）。

表5 初始因子載荷矩陣及主成分因子的特征向量

為了更直觀地反映不同大樹茶的品質，采用正交旋轉法對大樹茶品質所對應數據的主成分因子進行旋轉，并計算各個指標的特征向量系數，結果見表5。根據表5的數據，建立主成分與不同大樹茶品質指標之間的表達式[15]。

以大樹茶水分含量（X1）、游離氨基酸總量（X2）、茶多酚含量（X3）、咖啡堿含量（X4）、EGCG含量（X5）及兒茶素總量（X6）為初始自變量，經過主成分分析，最終得出2個主成分因子的方程表達式如Z1～Z2所示，這2個主成分因子將原來6個品質指標作線性變換，重新組合成一組新的互相無關的綜合指標，消除不同大樹茶品質6個指標間的相關性，涵蓋大樹茶品質指標的大部分信息，可代替6個品質指標進行大樹茶加工評價模型的建立。

2.4 大樹茶品質指標歸一化

經回歸線性相關性分析，大樹茶綜合指標Y與大樹茶水分相關系數為0.091；與游離氨基酸的相關系數為0.242；與茶多酚相關系數為0.395；與咖啡堿相關系數為0.454；與EGCG相關系數為0.438；與兒茶素相關系數為0.399；與主成分因子的方程Z1和Z2的相關系數分別為0.966和0.982；綜合指標與各項大樹茶評價指標在顯著性水平為0.01上正相關，說明利用該方法得到的綜合加工指標準確可靠。

2.5 大樹茶品質評價模型建立

以2個主成分因子Z1和Z2為自變量，歸一化后綜合加工品質指標Y為因變量，采用逐步回歸分析方法建立多元線性回歸方程。設置進入值為0.05，移出值為0.1，即：如果一個變量的F值的概率小于0.05，那么這個變量將被選入回歸方程中；變量的F值的概率大于設置的剔除值0.1，則變量將從回歸方程中被剔除。由于自變量Z1和Z2與因變量Y的顯著性的概率小于0.05，得到逐步回歸方程[16]。

由模型系數表（表6）可看出，自變量顯著性水平Sig.=0.000均小于0.05，說明自變量對因變量影響效果顯著，存在顯著線性關系。

表6 大樹茶綜合品質評價模型系數

大樹茶綜合品質評價模型[17]的有效性是通過決定系數R2和F檢驗進行判斷的。對模型進行效果匯總：回歸模型的決定系數R2=0.999，調整后R2=0.999，隨機誤差估計值小，說明模型擬合度較高，能滿足實際需求，使用模型評價大樹茶綜合品質有效。將Z1和Z2替換為初始自變量X1～X6，整理得大樹茶片綜合指標與不同品質的回歸模型。

2.6 模型驗證

分別選取20份大樹單株茶樣品驗證回歸模型效果[18]，將20份單株的6個初始指標數據代入大樹茶綜合品質評價模型，得出品質綜合指標預測值，將預測值與綜合品質指標真值進行對比驗證，得出的真值與預測值相關系數為0.991，顯著性為0.014小于0.05，即在0.05水平上顯著相關，說明大樹茶綜合品質評價模型能有效地預測大樹茶的品質。圖1為驗證試驗的真值與預測值散點圖，樣品點較集中分布在45°線周圍，表明預測值接近真值，即通過測定不同大樹茶的水分含量、游離氨基酸、茶多酚、咖啡堿、EGCG及兒茶素含量，就可以較準確地預測大樹茶的綜合品質。

2.7 不同大樹茶單株綜合指標評價

對20份大樹茶單株綜合評價指標進行排序，結果如表7所示。

采用K-means聚類算法[19-20]對20份大樹茶單株綜合指標進行聚類分析，設置k=3，聚類中心沒有改動達到收斂時迭代停止，最終迭代次數為10，將20份單株的綜合品質初步劃分AAA、AA、A這3類（表8）。

圖1 綜合評價指標預測值與真值散點圖

表8 20份大樹茶綜合品質指標分類

3 討論與結論

試驗收集了習水大樹茶資源的20份大樹茶單株進行制樣，測定水分、游離氨基酸、茶多酚、咖啡堿、EGCG及兒茶素含量6項指標，對大樹茶研究原料的6個主要品質指標進行主成分分析，得出2個主成分因子，從而消除原料各個指標間的相關關系，降低后期數據處理的冗余性；通過數據指標歸一化方法[20]將大樹茶各個指標轉化為一組具有代表性的綜合評價指標，并將綜合評價指標Y與主成分因子（Z1～Z2）進行逐步回歸分析，代入初始自變量X1～X6，整理得大樹茶綜合指標與6個品質的回歸模型，回歸模型的決定系數R2=0.999[22]，調整后R2=0.999，隨機誤差估計值小，表明該模型可以較準確地預測未知樣品的大樹茶加工品質；預測值與綜合品質指標真值進行對比驗證，得出真值與預測值相關系數為0.991，顯著性為0.014，小于0.05，說明回歸模型能有效地預測大樹茶加工后品質；應用K-means算法對20份大樹茶單株的綜合指標進行初步聚類，篩選出3個AAA大樹茶單株，與實際應用情況相符。試驗建立的大樹茶品質評價模型效果顯著，可應用于實際大樹茶綜合品質評價[23]，后期將進一步擴大建模樣品數量，探討多樣建模方法，以增強模型的適用性和精確度；此外，大樹茶油綜合品質K-means聚類的合理性和科學性需進一步探討，綜合品質分類依據及類別將今后研究中繼續完善并驗證。