冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶的粗分離與性質

趙莉君，駱震，趙改名*，黃明遠，廖章伊，呂婕

1. 河南農業大學食品科學技術學院（鄭州 450002）；2. 河南中煙工業有限責任公司（鄭州 450000）

冷鮮牛肉滋味鮮美、營養豐富，深受消費者喜愛，消費量持續增加[1-2]。然而，冷鮮牛肉在流通貯藏中容易出現顏色劣變的問題，降低消費者的購買欲望，給生產經營者造成大量損失[3]。導致冷鮮牛肉顏色劣變的因素有很多，比如光照、溫度、pH、氧分壓等[3-7]。其中一項關鍵因素是牛肉中氧合肌紅蛋白（MbO2）與氧結合轉化為高鐵肌紅蛋白（MMb），從而使牛肉由鮮紅色變為暗紅褐色，而高鐵肌紅蛋白還原酶（MetMbR）可以延緩這一進程，從而阻止冷鮮牛肉顏色劣變[3-7]。

研究表明，不同品種牛肉或同一品種不同部位牛肉中高鐵肌紅蛋白還原酶的活性及性質均有所差異[7-9]。牛肉中高鐵肌紅蛋白還原酶分離提純的方法也有所不同，常用有鹽析法、離心法、超濾法和層析法等[10-11]。Hagler等[12]早期用硫酸銨鹽析法、柱層析法分步分離提純牛心肌高鐵肌紅蛋白還原酶，為高鐵肌紅蛋白還原酶的分離純化奠定基礎，之后對于不同動物、不同部位肌肉中的高鐵肌紅蛋白還原酶的提取多在此基礎上進行優化。以冷鮮牛背最長肌和冷鮮牛腰大肌為原料，采用硫酸銨鹽析法分別對2個部位牛肉中的高鐵肌紅蛋白還原酶進行粗分離，并對所得粗酶液中的高鐵肌紅蛋白還原酶適宜溫度和pH進行分析，為冷鮮牛肉中高鐵肌紅蛋白還原酶的研究提供參考，為冷鮮牛肉肉色穩定性的提高提供依據。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

不同部位冷鮮牛肉（背最長肌、腰大肌，購自鄭州黃家牛肉連鎖店）；還原型輔酶Ⅰ二鈉、馬骨骼肌肌紅蛋白（美國Sigma公司）；磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉（天津市光復科技發展有限公司）；鐵氰化鉀、亞鐵氰化鉀（天津市金瑞化工有限公司）；Premixed Protein Marker（Broad，TAKARA BIO INC）；硫酸銨、乙二胺四乙酸鈉（國藥集團化學試劑有限公司）；2x蛋白質上樣緩沖液（北京索萊寶科技有限公司）。

1.2 主要儀器與設備

T10高速分散器（科冉儀器公司）；JYL-D055小型絞肉機（北京九陽有限公司）；Pxsj-216離子計（雷磁上海儀電科學儀器股份有限公司）；HH-601A高精度超級恒溫水浴（金壇市國旺實驗儀器廠）；UV-2600紫外可見分光光度計（天美（中國）科學儀器有限公司）；Multifuge X1R臺式冷凍離心機（賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；JA2003N電子精密天平（上海江儀儀器有限公司）；JB-1A攪拌器（雷磁上海儀電科學儀器股份有限公司）；DYY-5型穩壓穩流電泳儀（北京六一儀器廠）。

1.3 試驗方法

1.3.1 高鐵肌紅蛋白還原酶粗酶液的提取

參照王瑋[11]、Reddy等[13]的方法并稍作改進。將肉樣切丁去筋膜，稱取5 g后攪碎，加入20 mL緩沖液，用高速分散器均質1 min，于4 ℃、10 000 r/min下離心20 min，上清液加入800 μL高鐵氰化鉀，由鮮紅變為褐色，透析（截留分子量10 000 Da）24 h，于4 ℃、10 000 r/min下離心30 min，取上清液定容到25 mL作為高鐵肌紅蛋白還原酶粗提液。

1.3.2 高鐵肌紅蛋白還原酶酶活測定

依據謝麗等[7]、王永林等[14]的方法進行高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定。馬骨骼肌蛋白標品每100 mg用緩沖液溶解氧化12 h后稀釋備用，配制反應組分見表1，反應溫度保持25 ℃，用水替代NADH作為空白對照，其余不變。

表1 高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定反應組分

1.3.3 高鐵肌紅蛋白還原酶的粗分離

使用硫酸銨鹽析法對高鐵肌紅蛋白還原酶進行粗分離：取制好的粗酶液加入固體硫酸銨至50%飽和度，邊攪拌邊緩慢加入硫酸銨，使用磁力攪拌器攪拌20 min后，于4 ℃條件下靜置2 h，10 000 r/min離心20 min，取上清液加入固體硫酸銨至60%飽和度，并依此法操作至90%飽和度，對50%～90%硫酸銨飽和度的樣品沉淀（將沉淀溶于pH 7.0磷酸緩沖液中）透析脫鹽并進行酶活測定[15]。

1.3.4 蛋白質含量的測定

采用分光光度法進行蛋白質含量的測定[16]，得到標準曲線：y=0.005 1x+0.013 9，R2=0.996 1。

1.3.5 SDS-PAGE電泳

按SDS-PAGE電泳操作標準進行試驗[15]，其中，分離膠濃度12%，濃縮膠濃度5%，Maker的分子量范圍為6.5～200 kDa。

1.3.6 高鐵肌紅蛋白還原酶適宜pH及溫度

分別將整個反應體系組分置于25，30，35，40和45 ℃水浴鍋中20 min，使體系在不同溫度下反應，按照1.3.2進行酶活測定。分別使用pH 5.5，6.0，6.5，7.0和7.5的磷酸鹽緩沖液溶解樣品后，按照1.3.2進行酶活測定。

1.4 數據分析

采用Microsoft Excel 2010、SPSS 16.0軟件進行數據統計分析。

2 結果與分析

2.1 2個部位冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性

冷鮮牛背最長肌和牛腰大肌粗酶液樣品的SDSPAGE電泳結果見圖1。由圖1可知，冷鮮牛背最長肌和牛腰大肌粗酶液中的蛋白分子量主要范圍在14.3～97.2 kDa之間。

冷鮮牛背最長肌和牛腰大肌中高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定結果見表2。由表2可知，2個部位冷鮮牛肉的高鐵肌紅蛋白還原酶活性之間存在顯著性差異（p＜0.05）。牛背最長肌中的高鐵肌紅蛋白還原酶活性明顯高于牛腰大肌（p＜0.05），與文獻[7]報道結果一致，這也是牛背最長肌肉色穩定性優于牛腰大肌的原因之一。

圖1 2個部位冷鮮牛肉粗酶液的SDS-PAGE電泳圖

表2 不同部位冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定結果

2.2 冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶的粗分離

硫酸銨鹽析結果見表3。由表3可知，硫酸銨飽和度不同，所得沉淀中的高鐵肌紅蛋白還原酶活性間存在明顯差異（p＜0.05）。牛背最長肌和牛腰大肌均在硫酸銨飽和度為70%時，高鐵肌紅蛋白還原酶活性最高，分別為48.33和23.30 U/mL。

表3 不同硫酸銨飽和度下冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定結果

分步提取物中高鐵肌紅蛋白還原酶的比活力與得率見表4。由表4可知，經過硫酸銨鹽析，冷鮮牛肉中的高鐵肌紅蛋白還原酶得到初步分離。

表4 不同部位冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶粗分離結果

2.3 冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶的適宜溫度和pH

不同溫度下，冷鮮牛背最長肌和牛腰大肌中高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定結果見表5。由表5可知，試驗范圍內，30～45 ℃冷鮮牛背最長肌的高鐵肌紅蛋白還原酶活性間無明顯差異（p＞0.05）。溫度不同，冷鮮牛腰大肌的高鐵肌紅蛋白還原酶活性間存在顯著性差異（p＜0.05）。冷鮮牛腰大肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性適宜的反應溫度為35 ℃。

表5 不同溫度下冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定結果

不同pH下，冷鮮牛背最長肌和牛腰大肌中高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定結果見表6。由表6可知，試驗范圍內，冷鮮牛背最長肌高鐵肌紅蛋白還原酶的適宜pH為6.5（p＜0.05）。pH不同，冷鮮牛腰大肌的高鐵肌紅蛋白還原酶活性間存在顯著性差異（p＜0.05）。冷鮮牛腰大肌高鐵肌紅蛋白還原酶活性的適宜pH為6.0～6.5。

表6 不同pH下冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶活性測定結果

3 結論

冷鮮牛背最長肌和牛腰大肌中高鐵肌紅蛋白還原酶的活性分別為94.33和53.60 U/mL。經硫酸銨鹽析，冷鮮牛肉高鐵肌紅蛋白還原酶可得到粗分離，適宜的硫酸銨飽和度為70%。冷鮮牛背最長肌和牛腰大肌高鐵肌紅蛋白還原酶的適宜溫度分別為30～45 ℃和35℃，適宜pH分別為pH 6.5和pH 6.0～6.5。