雞蛋中硝基咪唑類藥物及其代謝物殘留風險篩查

梁飛燕，辛麗娜*，林小瑩

廣西-東盟食品檢驗檢測中心（南寧 530021）

硝基咪唑類藥物是一類具有5-硝基咪唑環結構的化合物，其作用機制主要是破壞細菌細胞胞漿中的硝基還原酶，從而干擾細菌DNA代謝過程，引起細菌DNA螺旋鏈的損傷、斷裂、解旋，進而導致細菌死亡。硝基咪唑類主要用于抗滴蟲、抗阿米巴原蟲和抗厭氧菌感染，對禽類弧菌性肝炎、禽類毛滴蟲病、大腸桿菌和沙門氏菌感染等有良好療效。但該類藥物具有細胞誘變性、動物致癌毒性[1]，其代謝物與原藥具有相似的潛在毒性[2]，故歐盟、美國、日本等已規定甲硝唑、地美硝唑禁用于食品動物。我國農業部第235號公告對甲硝唑、地美硝唑做出規定：允許在食品動物中使用，但是不得在動物食品中檢出。

目前，對于動物性食品中硝基咪唑類藥物殘留的檢測方法，我國目前現行的標準有GB/T 21318—2007《動物源性食品中硝基咪唑殘留量檢驗方法》、SN/T 1928—2007《進出口動物源性食品中硝基咪唑殘留量檢測方法液相色譜-質譜質譜法》、農業部1025號公告-2-2008《動物性食品中甲硝唑、地美硝唑及其代謝物殘留檢測液相色譜-串聯質譜法》、農業部1025號公告-22-2008《動物源食品中4種硝基咪唑殘留檢測液相色譜-串聯質譜法》等，但這些標準只適用于禽畜肉及其內臟、水產品、蜂蜜、乳及乳制品，對于禽蛋中硝基咪唑類藥物殘留，缺乏相應的國家標準，導致監管部門在執行禽蛋質量安全監管中無理可據，給監管帶來了一定困難。

大多數硝基咪唑類藥物半衰期長，在體內吸收迅速而且完全并能保持有效濃度，蛋白結合率低，在體液和組織中分布廣泛[3]，對治療雞生殖系統疾病及一些傳染病引起的生殖系統驗證效果好，若不遵守獸藥休藥期規定，在蛋雞產蛋期使用此類獸藥，可能會導致硝基咪唑類藥物在雞蛋中的殘留。考察和掌握雞蛋中硝基咪唑類藥物及代謝物的殘留情況，對建立健全我國標準體系提供技術支持，為監管部門提供監管依據，對保障公眾的飲食安全和公共衛生安全都具有重要的意義。為此，通過建立液相色譜-串聯質譜法，對雞蛋中硝基咪唑類藥物及代謝物展開風險監測篩查。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

QTRAP4500三重四極桿液質聯用儀（美國AB公司），配30A高效液相色譜儀（日本島津公司）；PGC753e型電子天平，艾德姆衡器（武漢）有限公司；Multi Reax型全自動振蕩器，Heidolph公司；X3R型高速冷凍離心機，Thermo公司；Genius NM32LA型氮氣發生器，PEAK公司；ATR Autovap S60型多樣品自動濃縮儀，力德生物科技（上海）有限公司；Milli-Q Advantage A10超純水機，德國Millipore公司；PRime HLB固相萃取小柱（6 mL，500 mg），美國Waters公司；MCX陽離子交換柱（6 mL，150 mg），美國Waters公司。

1.2 試劑

甲硝唑標準品，中國食品藥品檢定研究院；地美硝唑（二甲硝咪唑）標準品，Bepure公司；洛硝噠唑（羅硝唑）標準品，Dr. Ehrenstorfer公司；2-甲硝咪唑標準品，CATO公司；異丙硝唑標準品，Dr. Ehrenstorfer公司；4-硝基咪唑標準品，Dr. Ehrenstorfer公司；苯硝咪唑標準品，WiTEGA公司；羥基甲硝唑（甲硝唑代謝物）標準品，Bepure公司；羥甲基甲硝咪唑（洛硝噠唑、2-甲硝咪唑代謝物）標準品，WiTEGA公司；乙酸銨，色譜純，美國Tedia公司；甲酸，分析純，廣東省化學試劑工程技術研究開發中心；水，超純水。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品處理

取約2.50 g（精確到0.01 g）均質后的雞蛋于50 mL聚酯離心管中，加入90%乙腈水溶液至10.0 mL，渦旋振蕩10 min，在1 000 r/min條件下冷凍離心5 min。取上層提取液置于Oasis PRiME HLB固相小柱（500 mg，6 mL，無需活化）內，以1 s/滴的速度過柱，收集4.0 mL流出液，于40 ℃氮氣吹干至小于0.5 mL，用10%乙腈水溶液定容至1.0 mL，渦旋溶解2 min，以10 000 r/min離心5 min，取上清液，經0.22 μm濾膜過濾后待測。

1.3.2 標準儲備溶液的配制

分別準確稱取10.0 mg 9種標準品于10 mL容量瓶中，用乙腈溶解并定容至刻度，制成1 mg/mL的單標儲備溶液。分別吸取0.1 mL至同一100 mL容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，制成1 μg/mL的混合標準溶液。

1.3.3 基質標準曲線的配制

稱取2.50 g雞蛋樣品空白基質，分別加入混合標準溶液，按1.3.1方法處理樣品，制得質量濃度分別為0.5，1，5，10，20和50 ng/mL的基質混合標準工作溶液，以濃度為橫坐標，相應定量離子的色譜峰面積為縱坐標，繪制標準曲線。

1.4 儀器條件

1.4.1 色譜條件

色譜柱為CAPCELL PAK C18MGⅢ-H（3 μm，2.0 mm×100 mm），流動相A為0.1%甲酸水，流動相B為乙腈，梯度洗脫程序見表1。流速0.3 mL/min，進樣量20 μL，柱溫35 ℃。

表1 梯度洗脫程序

1.4.2 質譜條件

電噴霧離子源（ESI），多反應監測（MRM）；正離子掃描模式。電噴霧電壓（IS）5 500 V；離子源溫度（TEM）550 ℃；氣簾氣（CUR）流速35 L/min；霧化氣（GS1）流速55 L/min；輔助加熱氣（GS2）流速55 L/min；射入電壓（EP）10 V。

表2 9種組分的質譜參數

2 結果與討論

2.1 條件的優化

2.1.1 儀器條件的優化

因C18色譜柱比C8柱具有更強的保留性，故考察了4種不同廠家的C18色譜柱CAPCELL PAK C18MGⅢ-H（3 μm，2.0 mm×100 mm）、Waters ACQUITY UPLC? BEH C18（1.7 μm，2.0 mm×150 mm）、Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（1.8 μm，2.1 mm×150 mm）、Phenomenex Kinetex XB-C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）對9種待測組分的分離效果和柱效[4-5]。結果發現：CAPCELL PAK C18MGⅢ-H（3 μm，2.0 mm×100 mm）對9種待測組分的分離度和峰形更好，且分辨率高，因此選用該色譜柱進行測定。

分別采用甲醇-水、乙腈-水、乙腈-0.1%甲酸水、乙腈-5 mmol/L乙酸銨水溶液等多種流動相進行考察。采用乙腈-0.1%甲酸水溶液時待測組分離子質譜的分離度和響應值最高[6-9]。所以采用多反應監測模式正離子進行測定，通過調節質譜的電噴霧電壓（IS）、離子源溫度（TEM）、氣簾氣（CUR）等參數，采用響應最強和次強的子離子分別作為定量離子和定性離子。通過梯度洗脫改變流動相的比例，使9種待測組分達到完全分離，保留時間重現性好，靈敏度高，見圖1。

圖1 儀器條件優化效果圖

2.1.2 前處理條件的優化

雞蛋的主要成分是蛋白質和脂肪，乙腈具有沉淀蛋白的作用。試驗發現：90%的乙腈更利于硝基咪唑類藥物的提取，回收率較高且峰形較好，故采用90%乙腈作為提取溶劑。

PRIME HLB固相小柱填料為水可浸潤性的親水親脂平衡共聚物，使用前無需活化和平衡，對各種蛋白、磷脂、鹽等基質干擾物具有吸附保留作用。試驗比較了Waters HLB固相小柱、MCX陽離子交換固相萃取小柱和PRIME HLB固相小柱的提取效果[10-13]，結果發現：Waters HLB固相小柱過柱時易造成柱子堵塞，回收率低且平行性差；MCX陽離子交換固相萃取小柱由于凈化不完全，造成基質效應大而導致回收率偏低；PRIME HLB固相小柱凈化效果好，凈化過程簡單、快速，提取回收率高，見圖2，故采用PRIME HLB固相小柱進行凈化。

2.2 方法學驗證

2.2.1 線性范圍、檢出限和定量限

按試驗方法配制系列基質標準曲線，采用選定的儀器條件進行檢測，以待測組分定量離子濃度為橫坐標、相應峰面積為縱坐標，繪制工作曲線。結果顯示，9種組分在0.5～50 μg/mL范圍內與峰面積呈良好的線性關系，相關系數為0.996 1～0.999 0。在雞蛋基質空白中添加適當濃度的標準溶液，以定量離子按信噪比S/N=3、S/N=10分別計算檢出限和定量限，9種組分的檢出限為0.001 6～0.020 μg/kg，定量限為0.005 3～0.067 μg/kg，結果見表3。

圖2 使用PRiME HLB凈化效果離子流圖

表3 雞蛋中9種組分的線性方程、相關系數及檢出限、定量限

2.2.2 回收率和精密度

在雞蛋空白基質中添加低、中、高3個不同濃度水平的標準溶液，按試驗方法制備樣品并上機測定，每個濃度水平各3份，測定回收率和精密度。結果顯示，低、中、高3個濃度水平的回收率為86.0%～109.41%，RSD為0.41%～5.60%，均符合國家標準相關要求，結果見表4。

表4 雞蛋中9種組分加標回收率及精密度（n=3）

2.3 實際樣品的檢測

為了對雞蛋中硝基咪唑類藥物及代謝物進行風險篩查，在農貿市場、超市等流通領域共采樣82批次，采用了此次試驗建立的方法進行檢測，檢測結果見表5。4批次樣本檢出硝基咪唑類藥物，檢出率為4.88%，檢出組分為甲硝唑、地美硝唑、羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑，檢出甲硝唑、地美硝唑的樣品均檢出其相應代謝物羥基甲硝唑、羥甲基甲硝咪唑。

表5 樣品測定結果

3 結論與討論

動物源性食品中獸藥殘留風險評估主要是采用食品安全指數來進行評價的[14]，食品安全指數為每日膳食暴露量與某藥物的每日允許攝入量（ADI）的比值。其中，每日允許攝入量（ADI）是保障獸藥不對人體健康造成潛在危害的“臨界值”，是評判獸藥安全性的根本標準。每日允許攝入量（ADI）值的設置，是通過一系列嚴格且復雜的毒理學、藥理學或微生物學安全性評價程序而得到的。動物源性食品中獸藥最高殘留量（MRL）的設置也是通過對藥物的化學性質、代謝、殘留實驗數據分析，飲食暴露評估等確定的。甲硝唑、地美硝唑因沒有足夠數據或缺乏相關數據來確定食品中該藥物或其代謝物的殘留安全水平，但是相關健康問題已成為嚴重關注問題，因此大部分國家對此類藥物在食品中的殘留，規定不得在食品動物上使用該類藥物或不得在動物食品中檢出。我國農業部第235號公告規定甲硝唑、地美硝唑允許作治療用，但不得在動物性食品中檢出；農業部第193號公告亦規定了硝基咪唑類：甲硝唑、地美硝唑及其鹽、酯及制劑禁止以促生長的目的用于所有食品動物。硝基咪唑類藥物在動物食品中殘留給人體帶來的健康風險已得到了有關部門的關注和重視。

對于雞蛋中硝基咪唑類藥物殘留的檢測，我國缺乏配套的標準方法。為此次雞蛋中硝基咪唑類藥物及其代謝物的風險篩查，建立了硝基咪唑類藥物及代謝物的檢測方法，該方法簡單快速、靈敏、準確，可用于禽蛋中獸藥殘留的大批量篩查，為食品安全監管部門提供技術支持，對雞蛋中硝基咪唑類藥物及代謝物檢測標準的研究和制定提供一定的參考作用。硝基咪唑類藥物主要用于禽類感染性疾病，并具有促生長作用，此類藥物在雞蛋中的殘留，可能是養殖戶超劑量使用或不遵守休藥期規定而導致的。通過對雞蛋中硝基咪唑類藥物及代謝物的殘留風險篩查和分析，了解和掌握雞蛋中硝基咪唑類藥物殘留的現狀和原因，為農業部門指導獸藥的科學、合理、安全使用提供依據，為食品安全監管部門對雞蛋中獸藥殘留的監管提供新思路，在一定程度上有利于提高雞蛋質量安全。