高壓均質對乳清蛋白糖基化產物抗氧化的影響

于鵬

乳業生物技術國家重點實驗室，上海乳業生物工程技術研究中心，光明乳業股份有限公司乳業研究院（上海 200436）

乳清蛋白因其較高的營養價值及良好的消化吸收特性，在食品工業中應用廣泛[1]。研究表明乳清蛋白的功能特性受到加工處理條件的影響而發生顯著變化。熱處理是乳品加工過程中最基本和普遍的操作單元。在加熱過程中，牛乳中的蛋白質與乳糖或者其他碳水化合物會發生美拉德反應，從而改變其營養、消化性等功能特性[2]。近些年，針對目標蛋白質與各種碳水化合物的反應機制及糖基化對蛋白質功能特性的改變的研究逐漸涌現[3-4]。

巖藻多糖是一種富含硫酸基的大分子多糖，廣泛存在于褐色海藻中。隨著研究的深入，巖藻多糖日益凸顯的生物活性功能，特別是在抗氧化[5]、抑制腫瘤[6]及提高免疫力[7]等方面逐漸受到關注。然而巖藻多糖生物活性功能受到分子結構、硫酸基團含量及分子量大小等多種因素的影響[8]。高壓均質，特別是超高壓均質作為一種新興的加工處理方式，正逐漸成功應用到食品和醫藥領域[9-10]。在加工處理過程中，由高壓均質帶來的強烈的剪切力和湍流會對被處理物質的分子結構或功能特性產生一定的影響[11]。Doost等[12]研究發現牛血清蛋白與和半乳糖經過高壓均質處理后，在55 ℃，相對濕度65%下反應6 h后，蛋白質的二級和三級結構會發生變化。Li等[13]通過研究表明隨著均質壓力的增加，巖藻多糖分子量隨之下降，同時其體外抗氧化能力呈增強趨勢。

雖然關于糖基化的研究較多，但是乳清蛋白和巖藻多糖的相關研究仍較少。高壓均質對乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產物的抗氧化性能的研究鮮見報道。試驗通過對乳清蛋白-巖藻多糖混合物進行高壓均質處理，研究不同均質壓力對2種混合物后期糖基化產物的抗氧化特性的影響。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

90%乳清分離蛋白BiPRO?（美國安格普有限公司）；巖藻多糖（北京雷力聯合海洋生物科技有限公司）；1, 1-二苯基-2-三硝基苯肼（DPPH，東京仁成工業株式會社（TCI））；其他試劑均為國產分析純。

1.2 儀器與設備

Five Easy pH計（梅特勒-多利多國際有限公司）；恒溫恒濕培養箱HPP110（德國美墨爾特（Memmert）有限公司）；FA2014分析天平（上海天平儀器廠）；紫外分光光度計SP-752（上海光譜儀器有限公司）；真空冷凍干燥機Free Zone（LABCONCO）。

1.3 方法

1.3.1 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產物的制備

乳清蛋白和巖藻多糖按照質量比1∶3溶于蒸餾水中，用乳酸調節至pH 6，充分混勻后分別經過0，70和120 MPa壓力均質，均質后的溶液置于-80 ℃冰箱中凍存一晚，置于凍干機中凍干至少48 h。稱取2 g左右的凍干粉均勻平鋪于培養皿中，置于相對濕度79%、溫度55 ℃恒溫恒濕培養箱中反應一定時間制得乳清蛋白-巖藻多糖共聚物（WPI-FD）。

1.3.2 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產物褐變程度的測定

根據前期試驗方案和Corzo-Martínez等[14]研究方法，精確稱取0.1 g糖基化反應共聚物WPI-FD，用去離子水溶解后定容至100 mL，分別在294和420 nm下測定其吸光度。樣品的吸光度若超過1.5，可對其進行適當稀釋，以保證吸光度在分光光度計檢測最佳范圍內，每個樣品檢測3次。

1.3.3 乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產物DPPH自由基清除能力測定

參考前期試驗方法。稱取0.1 g WPI-FD，然后用去離子水混合均勻后定容至25 mL容量瓶中配制成4 mg/mL溶液。取2 mL混合液與2 mL 0.1 mmol/L DPPH混勻后放置于37 ℃暗室培養箱中反應30 min，在517 nm波長處測定其吸光度，根據式（1）計算DPPH自由基清除率，每個樣品重復3次。

式中：Ai為樣品和0.1 mmol/L DPPH（1∶1，V/V）混合液吸光度；At為樣品和無水乙醇（1∶1，V/V）混合液吸光度；A0為無水乙醇和0.1 mmol/L DPPH（1∶1，V/V）混合液吸光度。

2 結果與分析

2.1 不同均質壓力條件下乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產物褐變程度

從圖1可以看出，糖基化反應能夠顯著改變乳清蛋白和巖藻多糖混合物的外觀特征，隨著糖基化反應進行，樣品的顏色逐漸由淺變深。為了更好評價糖基化反應的褐變程度，進而了解反應體系的糖基化進程，試驗過程中分別在290和420 nm條件下對糖基化產物的吸光度進行了測定，相關結果見表1。

由圖1和表1可知，均質壓力增加，可以改變乳清蛋白-巖藻多糖混合物的外觀顏色。在0 h時，乳清蛋白-巖藻多糖混合物在294和420 nm的吸光度隨著均質壓力增加而逐漸增大，說明乳清蛋白-巖藻多糖混合物在均質過程中會受到一定程度的熱負荷影響，從而促使蛋白質和多糖發生反應[15]。從圖1可以看出乳清蛋白-巖藻多糖樣品經過120 MPa處理后（C）顏色較未經過或者低壓處理的組（A和B）更深，類似結果在Grácia-Juliá等[16]研究中得到體現。Huang等[17]通過高分辨質譜研究表明高壓均質能顯著增加糖基化反應位點，100 MPa預處理對牛血清白蛋白糖基化反應的影響最為顯著。這與試驗結果較為相似，從表1可以看出，乳清蛋白-巖藻多糖樣品經過高壓均質后可以加速糖基化進程，相同條件下經過70 MPa及以上壓力均質后，樣品在80 h以后的吸光度無顯著變化（A420nm）。

圖1 不同條件下乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產物

表1 不同均質壓力條件下乳清蛋白-巖藻多糖糖基化反應褐變程度

2.2 不同均質壓力條件下乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產物DPPH自由基清除能力

DPPH自由基清除試驗被廣泛應用于體外抗氧化研究中，試驗通過對不同均質壓力條件處理下的乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產物的DPPH自由基清除率進行測定，試驗結果如表2所示。

由表2可知，隨著均質壓力增加，乳清蛋白-巖藻多糖混合物自由基清除率從58.89%顯著增加到65.98%（p＜0.05），120 MPa處理后的樣品自由基清除率比未處理組高12%左右，且隨著糖基化反應的進行，糖基化產物的抗氧化性能逐漸增加。0 MPa處理條件下乳清蛋白-巖藻多糖糖基化產物的DPPH清除率在80 h達到最大，隨后有輕微下降，但是變化并不顯著（p＞0.05）。由表2可見，動態超高壓均質處理后的樣品在反應60 h后，其糖基化產物自由基清除率基本趨于穩定，無顯著變化。這與未經均質處理的樣品相比，反應時間明顯提前。雖然乳清蛋白和巖藻多糖混合物經過120 MPa均質處理后，其糖基化產物在90 h時DPPH清除率達到最大，但是其與0 MPa（80 h）和70 MPa（80 h）下的糖基化產物的自由基清除率無明顯差異。這說明高壓均質可以增加乳清蛋白-巖藻多糖混合物的抗氧化能力，但是隨著糖基化反應的進行，最終反應產物的DPPH自由基清除率最終基本趨于一致。

均質壓力/MPa DPPH自由基清除率/%0 h 60 h 80 h 90 h 0 58.89±2.76a 67.72±2.39cd 72.23±0.97ef 69.78±2.14cde 70 62.38±2.53ab 70.89±4.88de 74.49±3.33ef 73.57±2.58ef 120 65.98±2.68bc 73.53±1.16ef 76.09±1.57f 77.49±0.78f注: 字母不同, 表示差異顯著 (p＜0.05)

3 結論

對不同均質條件下的乳清蛋白和巖藻多糖糖基化產物的反應特性和DPPH自由基清除率進行試驗。糖基化產物反應特性試驗結果表明，高壓均質能夠顯著改變乳清蛋白和巖藻多糖混合物的外觀色澤。隨著均質壓力增加，混合物的顏色逐漸由淺變深。同時高壓均質能夠瞬時促進蛋白質和多糖之間發生反應，從而加速糖基化反應進程。此外，高壓均質還可以提高糖基化反應產物體外抗氧化活性，均質組與非均質組相比，高壓均質可以縮短糖基化反應產物抗氧化性能達到最佳反應時間，但是高壓均質對乳清蛋白和巖藻多糖混合物最終的糖基化產物的DPPH自由基清除率大小的提升無顯著作用。