不同石斛品種的品質差異

徐雅囡，鐘淳菲，陳燕蘭，閆培睿，黎攀，杜冰*

1. 華南農業大學食品學院（廣州 510000）；2. 芒市土壤肥料工作站（德宏 678400）

石斛是蘭科石斛屬植物的統稱。道家經典著作《道藏》將其列為“中華九大仙草之首”[1]。我國有石斛屬植物74種2變種，主要分布于云貴、兩廣、海南及臺灣等地[2]。

傳統石斛質量評價以感官和形態為主，即以“莖粗，質重，嚼之粘牙，味苦，無渣”作為評價石斛品質的標準，但這一方法并不能完全體現其內在品質的優劣[3]。2015版《中國藥典》規定了鐵皮石斛的多糖和醇溶性浸出物含量標準，以此作為評價鐵皮石斛品質的重要標準之一。李曉軍等[4]以多糖含量和醇溶性浸出物含量為指標，分析了云南省不同產地和不同采收時間的鐵皮石斛之間的品質差異。結果顯示，不同采收期的鐵皮石斛多糖和醇溶性浸出物含量差異顯著。宋紅坤等[5]建立了HPLC特征圖譜，初步比較了流蘇石斛等8個品種，發現其所含化學成分差異較大，但均含有丁香酸、柚皮素、石斛酚、毛蘭素等。隨著現代研究技術的快速發展，石斛化學成分[6-9]和藥理活性[10-13]的研究越來越廣泛。但是在以往的研究中，對不同石斛品種間多指標比較的研究仍然較少，也沒有形成系統的石斛品種間質量評價體系。因此，此次試驗針對6個不同的石斛品種，測定其主要活性成分含量并分析多糖結構，進行差異性比較。以期為不同品種石斛的質量評價以及開發利用提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用到的6種石斛樣品分別為來自云南保山龍陵縣的S1-紫皮石斛、來自云南保山龍陵縣的S2-金釵石斛、來自云南保山龍陵縣的S3-鼓槌石斛、來自云南保山龍陵縣的S4-流蘇石斛、來自云南屏邊的S5-鐵皮石斛和來自安徽霍山縣衡山鎮的S6-霍山石斛。

1.2 試劑和儀器

無水葡萄糖對照品（LC，上海士鋒科技有限公司）；蘆丁對照品（LC，廣州市齊云生物技術有限公司）；苯酚（AR，廣州化學試劑廠）；硫酸（AR，天津富宇精細化工有限公司）；三氯甲烷（AR，廣州化學試劑廠）；無水乙醇（AR，天津富宇精細化工有限公司）。

RE-52A旋轉蒸發器（鞏義市予華儀器有限責任公司）；SHA-D（Ⅲ）型循環水真空泵（上海一科儀器有限公司）；UV5100紫外分光光度計（上海元析儀器有限公司）；HH-2數顯恒溫水浴鍋（金壇市鴻科儀器廠）；DGG-9070B電熱恒溫鼓風干燥箱（上海森信實驗儀器有限公司）；BCD-256KF冰箱（海爾公司）；MAT 95XPThermo型質譜儀（Thermo公司）；LC-20A液相色譜儀（日本（島津）有限公司）；RID-10A示差折光檢測器（日本（島津）有限公司）。

1.3 活性成分含量測定

1.3.1 浸出物含量測定

浸出物含量的測定參照2015版《中國藥典》[14]附錄Ⅹ A浸出物測定法中的熱浸法。

1.3.2 可溶性固形物含量測定

可溶性固形物含量的測定參考NY/T 2637—2014[15]。

1.3.3 總黃酮含量的測定

參考唐靜月等[16]的蘆丁標準曲線法進行總黃酮含量的測定。

1.3.4 生物堿含量測定

參考王再花等[17]的方法進行石斛生物堿的測定。

1.3.5 多糖含量測定

參照2015版《中國藥典》[14]中鐵皮石斛多糖含量的測定項進行測定。

1.4 多糖結構的測定

1.4.1 多糖分子量測定

參考秦子芳等[18]的方法，采用高效凝膠滲透色譜法測定石斛多糖分子量。取石斛多糖樣品液，冷凍干燥后用ddH2O溶解成10 mg/mL的溶液，并過0.45 μm尼龍膜，即為多糖分子量測定樣品液。用pH 7.0的20 mmol/L磷酸緩沖液溶解系列已知分子量標準品（重均分子量分別為0.198，5，12，50，150，410，670，1 100和2 290 kDa），使其質量濃度為10 mg/mL。取20 μL樣品及系列標準品，分別注入液相色譜儀，記錄色譜圖。根據多糖標準品的分子量和色譜圖的保留時間，由GPC軟件處理，繪制標準曲線。再根據樣品的保留時間，用GPC軟件計算出多糖分子的分子量。

1.4.2 單糖組分測定

參考秦子芳等[18]的方法，將石斛粗多糖樣品通過SephadexG-50葡聚糖凝膠色譜柱進一步純化，將純化多糖水解、乙酰化，再進行GC-MS分析。

GC-MS條件：SE-30彈性石英毛細管柱（15 m×0.2 mm×0.33 μm），柱溫初溫100 ℃，以10 ℃/min程序升溫至280 ℃，保持10 min。載氣He，柱前壓70 kPa，分流比10∶1，溶劑延遲2 min，進樣量1.0 μL。EI離子源，電子能量70 eV，四極桿溫度150 ℃，離子源溫度230 ℃，電子倍增器電壓2 300 V，GC-MS接口溫度280 ℃，質量掃描范圍m/z29～500。

1.4.3 甘露糖與葡萄糖峰面積比測定

取不同石斛樣品多糖水解液，采用GC-MS進行甘露糖與葡萄糖的峰面積比測定，記錄甘露糖色譜峰與葡萄糖色譜峰，并計算甘露糖的峰面積與葡萄糖峰面積的比值。

2 結果與分析

2.1 不同品種石斛的浸出物含量分析

浸出物含量在一定程度上可以反映藥材質量，2015年《中華人民共和國藥典》將其作為評價石斛品質的標準之一。從表1可看到，來自云南保山龍陵縣的S2-金釵石斛、S3-鼓槌石斛、S4-流蘇石斛的水溶性浸出物的含量和醇溶性浸出物含量均遠高于其余三種石斛樣品，約為其他三種石斛樣品浸出物含量的2倍。其中以流蘇石斛的水溶性浸出物含量（15.18%）和醇溶性浸出物含量（11.08%）最高，而鐵皮石斛的水溶性浸出物含量（6.50%）和醇溶性浸出物含量（0.90%）最低。2015版《中國藥典》規定，鐵皮石斛中醇溶性浸出物含量不得低于6.5%。故該供試品S4-鐵皮石斛不符合《中國藥典》規定。對來自同一產地的四個石斛品種進行相關性分析，表3顯示，不同石斛品種間浸出物含量差異顯著。來自同一產地的不同品種石斛的水溶性浸出物含量從大到小排序為S4-流蘇石斛＞S2-金釵石斛＞S3-鼓槌石斛＞S1-紫皮石斛，醇溶性浸出物含量從大到小排序為S4-流蘇石斛＞S3-鼓槌石斛＞S2-金釵石斛＞S1-紫皮石斛。

表1 不同石斛樣品的活性成分含量表

2.2 不同品種石斛的固形物含量分析

由表2可知，S1-紫皮石斛的可溶性固形物含量最高（49.77%），S2-金釵石斛的可溶性固形物含量最低（9.24%）。二者均來源于云南保山龍陵縣，因此同一產地不同石斛品種間的可溶性固形物含量差異顯著，與表3的相關性分析結果一致。

表2 不同石斛樣品的活性成分含量表

2.3 不同品種石斛的總黃酮含量分析

研究表明，石斛中含有的黃酮類物質具有良好的抗氧化[16]作用和抗腫瘤[19]作用。從表2中看出，6種石斛樣品的黃酮含量在0.05%～0.24%之間，其中S2-金釵石斛的黃酮含量（0.24%）最高，S4-流蘇石斛的黃酮含量（0.05%）最低，這兩種石斛樣品均來自云南保山龍陵縣。對于來自同一產地的四種不同品種石斛樣品進行相關性分析，表3顯示，不同品種對石斛的黃酮含量具有極顯著的影響（p＜0.01）。來自云南保山龍陵縣的不同品種石斛黃酮含量從大到小排序為S2-金釵石斛＞S1-紫皮石斛＞S3-鼓槌石斛＞S4-流蘇石斛。

2.4 不同石斛品種的生物堿含量分析

石斛中的生物堿在改善胰島素抵抗[20]、保護肝臟脂質穩態[21]、保護大腦[22]等方面有明顯療效。6種不同品種石斛樣品中，S1-紫皮石斛生物堿含量最低，未檢出；S3-鼓槌石斛生物堿含量最高，為0.029%。對同一產地的4種石斛樣品進行聚類分析，發現同一產地的不同品種對石斛生物堿含量有極顯著影響（p＜0.01）。6種石斛樣品的生物堿含量從大到小排序為S3-鼓槌石斛＞S2-金釵石斛＞S5-鐵皮石斛＞S4-流蘇石斛、S6-霍山石斛＞S1-紫皮石斛。

2.5 不同石斛品種的多糖含量分析

石斛中所含有的大量多糖物質是石斛的主要功能成分之一，在增強機體免疫力[23]、抗衰老[24]等方面發揮著重要的作用。結果（表2）顯示，S6-霍山石斛的多糖含量最高，S5-鐵皮石斛和S1-紫皮石斛的多糖含量次之，而金釵、鼓槌、流蘇石斛的多糖含量偏低。對不同石斛品種和多糖含量進行相關性分析，表3顯示，不同石斛品種間多糖含量差異顯著。6種石斛樣品的多糖含量從大到小排序為S6-霍山石斛＞S5-鐵皮石斛＞S1-紫皮石斛＞S3-鼓槌石斛＞S2-金釵石斛＞S4-流蘇石斛。

表3 石斛品種與活性成分含量的相關性分析

2.6 多糖結構分析

2.6.1 多糖分子量

如表4所示，S2～S4石斛樣品的多糖色譜峰保留時間均在43.581～59.830 min之間，而S1和S6的色譜峰保留時間在61～64 min之間，為溶劑峰，沒有檢測到其多糖的分子量。多糖的均一性與分子量的分布（分布系數D）相關，D值越接近1，表示相應多糖樣品均一性越好。所以6種石斛樣品中，S2-金釵石斛和S4-流蘇石斛多糖的均一性最好。鐵皮石斛的D值達到7.92，說明其多糖是雜多糖。郝杰[25]在進行霍山石斛不同分子量多糖的抗氧化研究時，測得霍山石斛的重均分子量為252 189，低于鐵皮石斛，高于其他品種的石斛，在此次試驗結果范圍內。

2.6.2 多糖的單糖組分及含量分析

如表5所示，6種石斛樣品的單糖組成相近，分別是由4種六碳糖（鼠李糖、甘露糖、葡萄糖和半乳糖）和3種五碳糖（核糖、阿拉伯糖、木糖）組成。其中含量最高的兩種單糖均是甘露糖和葡萄糖，為石斛多糖組分中的主要單糖。張春燕等[26]研究了鐵皮石斛甘露糖的影響因素，結果顯示甘露糖在鐵皮石斛多糖中的含量與多糖含量呈正相關。表5顯示，S6-霍山石斛的甘露糖含量最高，S4-流蘇石斛的甘露糖含量最低，結合不同品種石斛的多糖含量（表3）發現不同品種石斛多糖的甘露糖含量與相應的多糖含量呈正比。因此，此次試驗結果與張春燕等[26]研究結果相一致。

表4 不同品種石斛多糖平均分子量及分布情況

表5 不同品種石斛多糖的單糖組成及含量 %

2.6.3 甘露糖與葡萄糖峰面積比分析

如表6所示，不同品種石斛多糖的甘露糖和葡萄糖含量存在差異。其中S6-霍山石斛甘露糖和葡萄糖的絕對峰面積最大，達到5×107以上。《中國藥典》規定，鐵皮石斛多糖的甘露糖與葡萄糖峰面積比應在2.4～8.0之間。表6顯示，6種石斛樣品甘露糖與葡萄糖峰面積比值均偏低，不符合藥典規定。

表6 不同石斛品種甘露糖與葡萄糖峰面積比

3 結論

對不同石斛品種之間活性成分含量和多糖結構進行比較分析，可知不同石斛品種間品質差異顯著。因石斛中活性成分復雜多樣，故不能以單個成分含量的高低來簡單判斷其品質的好壞。通常來說，水溶性浸出物中含有的活性物質主要是水溶性多糖，醇溶性浸出物中的活性物質有黃酮和石斛堿等。S2-金釵石斛、S3-鼓槌石斛、S4-流蘇石斛的浸出物含量較高，但其黃酮、生物堿和多糖含量并不高，所以可以推斷浸出物中除了含有以往研究中的一些活性成分外，還有其它成分的存在。余麗麗等[27]的研究表明，水溶性浸出物中除水溶性多糖外，還含有有機酸、苷類等，與此次試驗研究結果一致。因此浸出物含量的高低并不能絕對代表石斛品質的優劣。研究表明，石斛中黃酮物質的抗氧化性較好[28]，且石斛多糖具有諸多良好的藥理學活性[23-24]。多糖結構不同，其藥理作用也存在一定的差異。因此，多糖和黃酮含量常被用作評價石斛品質的重要標準。綜上所述，以浸出物含量、黃酮含量和多糖為主要評價指標，6種不同品種的石斛樣品以來自云南保山龍陵縣的S2-金釵石斛和來自安徽霍山縣衡山鎮的S6-霍山石斛品質較優。