SPE-HPLC/MS法監(jiān)測藍莓等漿果中氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺殘留

畢思遠，曹濤, *，朱志強，林燕翠，甘慧

1. 河北醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院（石家莊 050017）；2. 河北省環(huán)境與人群健康重點實驗室（石家莊 050017）；3. 廣東省檢迅檢測科技有限公司（東莞 523843）；4. 深圳市匯知科技有限公司（深圳 518101）

氟啶蟲酰胺是由日本石原產(chǎn)業(yè)株式會社發(fā)現(xiàn)的酰胺類殺蟲劑，它可以有效防治藍莓等漿果上的刺吸式口器害蟲，對蚜蟲尤其高效，對蜜蜂低毒[1-3]；溴氰蟲酰胺是杜邦公司開發(fā)的第二代酰胺類殺蟲劑，對鱗翅目害蟲具有特效。兩種酰胺類殺蟲劑具有廣譜、高效、低毒等優(yōu)點，與目前市售其他殺蟲劑無交互抗性，且對非靶標(biāo)生物安全，市場應(yīng)用極為廣泛[4-6]。藍莓等漿果由于果實裸露在環(huán)境中，含糖量高，極易引起病蟲害，因此在大棚種植過程中，均需噴灑一定量的農(nóng)藥以防止病蟲害，從而起到高產(chǎn)的作用，故加強對藍莓等漿果中的農(nóng)殘監(jiān)測具有十分重要的意義。

目前國內(nèi)外對藍莓等漿果中的氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺檢測的報道不多，方法主要有氣相色譜法、液相色譜法、氣相色譜質(zhì)譜法和液相色譜質(zhì)譜法[7-11]。氣相色譜法和液相色譜法檢出限高，不適用藍莓等漿果中的微量殘留檢測；氣相色譜質(zhì)譜法檢測溴氰蟲酰胺較好，但檢測氟啶蟲酰胺檢出限高，不適用2種酰胺類殺蟲劑的同時檢測；液相色譜質(zhì)譜法檢出限低，尤其對氟啶蟲酰胺響應(yīng)好。此次試驗開發(fā)一種利用固相萃取提取藍莓等漿果中的氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺，液相色譜質(zhì)譜法定性定量檢測的分析方法。結(jié)果證明，該方法具有操作簡單、檢出限低、檢測結(jié)果準(zhǔn)確等優(yōu)點，適用于藍莓等漿果中的農(nóng)殘檢測。

1 儀器與材料

1.1 儀器部分

超高壓液相色譜儀（SHIMADZU LC-30A型，島津科技有限公司）：質(zhì)譜儀（AB TRIPLE QUADTM 4500型，愛博才思科技有限公司）；色譜柱Zorbax Eclipse Plus C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm，安捷倫科技有限公司）；氮吹儀（美國N-EVAP-36型，Organomation科技有限公司）；均質(zhì)機（IKA T20型，艾卡科技有限公司）；渦旋混合器（GENIUS3型，艾卡科技有限公司）；電子天平（CPA2P-F型，賽多利斯科技有限公司）；超聲波清洗機（KQ 3200DE型，昆山舒美超聲儀器有限公司）；高速冷凍離心機（Neofuge 18R型，德國貝克曼科技有限公司）。

1.2 試劑部分

標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)：氟啶蟲酰胺（產(chǎn)品編號：GBW（E）082976）、溴氰蟲酰胺（產(chǎn)品編號：S-12886M1-1ML），質(zhì)量濃度均為100 μg/mL，農(nóng)業(yè)部環(huán)境保護科研監(jiān)測所；試劑：丙酮、乙腈、環(huán)己烷、乙酸乙酯，均為色譜純，MERCK試劑有限公司；乙酸銨：分析純，購自國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

1.3 儀器參數(shù)

1.3.1 液相色譜條件

流速為0.5 mL/min；色譜柱為Zorbax Eclipse Plus C18（100 mm×3.0 mm，1.8 μm）；柱溫為25 ℃；進樣量為10 μL；流動相A為10 mmol/L乙酸銨溶液；流動相B為甲醇；洗脫方式為梯度洗脫。梯度洗脫程序見表1。

表1 梯度洗脫程序

1.3.2 質(zhì)譜條件

離子化模式為ESI離子源；離子源溫度為600 ℃；氣源為氮氣；氣簾氣壓力為12 kPa；輔助氣壓1為45 kPa；輔助氣壓2為50 kPa；掃描模式為MRM（多反應(yīng)監(jiān)測）；離子噴霧電壓為5 400 V。

1.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液制備

混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液：取氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，各精密移取1.0 mL，置于10 mL量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻。氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺質(zhì)量濃度均為10 μg/mL。

標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液：取一定量混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，制成質(zhì)量濃度依次為0.02，0.05，0.1，0.2，0.5和1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻，得到標(biāo)準(zhǔn)工作曲線溶液。

1.5 樣品提取與凈化

取500 g藍莓（草莓、葡萄等）待測樣品，組織粉碎機粉碎；稱取10.0 g粉碎后的樣品，置于50 mL具塞離心管中，加入20.0 mL乙腈，均質(zhì)1 min；再加入約10 g無水硫酸鈉，渦旋混合3 min，冷凍離心10 min，精密吸取10.0 mL上清液置于刻度試管中，氮氣吹至剩余2～3 mL；取氨基固相萃取小柱（使用前先用5.0 mL水、5.0 mL乙腈活化），將上述2～3 mL溶液倒入固相萃取小柱中，加5 mL純化水凈化，再加10 mL乙腈洗脫，收集洗脫液，氮吹至近干，加甲醇定容至1.0 mL，渦旋混合1 min，0.22 μm有機濾膜過濾，即得。

2 結(jié)果與討論

2.1 前處理方法的選擇

藍莓等漿果基質(zhì)較為復(fù)雜，基質(zhì)中含有大量的蛋白質(zhì)、糖類、維生素等共存雜質(zhì)，因此選擇合適的前處理方法對檢測結(jié)果準(zhǔn)確性有著重要的影響。目前，漿果類水果前處理方法主要有固相萃取法、QuEChERS提取法、凝膠色譜凈化法等。凝膠色譜凈化，試劑使用量較大，對環(huán)境和檢測人員的影響較大，且凝膠色譜價格昂貴；QuEChERS提取法對蔬菜等基質(zhì)較為簡單的樣品前處理具有一定的優(yōu)勢，但由于藍莓等漿果基質(zhì)復(fù)雜，使用QuEChERS提取法凈化效果較差，背景干擾較大，處理完畢的樣品溶液對液相色譜-質(zhì)譜系統(tǒng)傷害較大；固相萃取法處理得到的樣品溶液，基質(zhì)相對干凈，更適用質(zhì)譜檢測。故選擇固相萃取法作為前處理方法。

2.2 固相萃取柱選擇

目前用于殺蟲劑凈化、提取的常用固相萃取柱主要有HLB固相萃取柱、氨基固相萃取柱和C18固相萃取柱。精密稱取10.0 g的待測樣品，置于50 mL具塞離心管中，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，再加入20.0 mL乙腈，均質(zhì)1 min，后續(xù)按照“1.5”樣品提取與凈化進行處理；同法保持其他條件不變，將固相萃取柱更換為其他兩種不同類型小柱，后續(xù)按照“1.5”樣品提取與凈化進行處理；分別得到上述3種固相萃取柱凈化、富集后的加標(biāo)樣品溶液，分別進樣分析。結(jié)果表明，C18固相萃取柱凈化、富集效果最差，氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺回收率均在60%以下；HLB固相萃取柱效果一般，氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺回收率分別為78.3%和84.1%；氨基固相萃取柱效果最好，氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺回收率分別為91.4%和87.9%。故選擇氨基固相萃取柱作為凈化、富集用小柱。

2.3 質(zhì)譜檢測參數(shù)優(yōu)化

取氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別配制約0.2 μg/mL的單標(biāo)溶液，加乙腈稀釋至刻度，搖勻；分別取上述單標(biāo)溶液，選擇質(zhì)譜模式，采用全掃描模式（Q1 SCAN）得到氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺的母離子；再采用產(chǎn)物離子掃描模式（PRODUCT ION SCAN），確定氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺的子離子，選擇響應(yīng)較高的1個子離子作為定量離子，再選擇1個子離子作為定性離子；最后對母離子與其對應(yīng)的2個子離子進行去簇電壓和碰撞電壓，優(yōu)化后，建立氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺的MRM的分析方法。優(yōu)化結(jié)果見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)優(yōu)化結(jié)果

2.4 線性曲線、線性范圍及檢出限

取一定量“1.4”混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，制成質(zhì)量濃度依次為0.02，0.05，0.1，0.2，0.5和1.0 μg/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別加甲醇稀釋至刻度，搖勻，待儀器穩(wěn)定后，分別進樣上述標(biāo)準(zhǔn)溶液。以氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺的響應(yīng)值作為縱坐標(biāo)（Y），相對應(yīng)的質(zhì)量濃度作為橫坐標(biāo)（X），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線；以3倍信噪比計算氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺的檢出限。結(jié)果見表3，典型譜圖見圖1。

表3 線性曲線、線性范圍及檢出限

圖1 典型色譜圖

2.5 加標(biāo)回收試驗

精密稱取10.0 g的待測樣品，置于50 mL具塞離心管中，分別加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，再加入20.0 mL乙腈，均質(zhì)1 min，后續(xù)按照“1.5”樣品提取與凈化進行處理，配制含氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺質(zhì)量濃度分別為0.02，0.1和0.5 μg·mL-1的加標(biāo)樣品溶液，待儀器穩(wěn)定后，分別進樣上述加標(biāo)溶液，以理論檢測結(jié)果與其對應(yīng)的實際加標(biāo)量分別計算三水平加標(biāo)回收率。結(jié)果表明，氟啶蟲酰胺加標(biāo)回收率范圍為87.7%～90.7%；溴氰蟲酰胺加標(biāo)回收率范圍為88.6%～103.4%，檢測結(jié)果準(zhǔn)確性較高。結(jié)果見表4。

表4 加標(biāo)回收試驗結(jié)果

2.6 重復(fù)性和精密度試驗

精密稱取10.0 g的待測樣品，置于50 mL具塞離心管中，加入一定量的混合標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液，再加入20.0 mL乙腈，均質(zhì)1 min，后續(xù)按照“1.5”樣品提取與凈化進行處理，配制含氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺質(zhì)量濃度0.1 μg·mL-1的加標(biāo)樣品溶液，同法配制6份加標(biāo)溶液，待儀器穩(wěn)定后，分別進樣分析，計算6次檢測結(jié)果重復(fù)性的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差：氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺分別為3.27%和4.11%；取草莓樣品，按照“1.5”樣品提取與凈化進行處理，得樣品溶液，同法處理6份，得6份樣品平行溶液；待儀器穩(wěn)定后，分別進樣分析，計算6次檢測結(jié)果精密度的相對標(biāo)準(zhǔn)偏差：氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺分別為3.71%和2.89%。試驗證明，該方法具有良好的重復(fù)性和精密度。

2.7 方法應(yīng)用

分別選取市售草莓、藍莓、葡萄等產(chǎn)品，分別按“1.5”樣品提取與凈化進行前處理，同法針對不同產(chǎn)品做質(zhì)控樣品，結(jié)果表明，該方法適用于藍莓等漿果類水果中氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺的檢測。檢測結(jié)果見表5。

表5 草莓、藍莓等檢測結(jié)果

3 結(jié)論

此次試驗建立了一種利用固相萃取凈化、提取藍莓等漿果中的氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺，液相色譜-質(zhì)譜法定性定量檢測的快速分析方法。對方法的前處理條件進行了研究，確定了前處理方法和固相萃取柱類型；并對質(zhì)譜檢測條件進行了優(yōu)化；最后對方法的加標(biāo)回收率、線性等進行了考察。結(jié)果表明，該方法具有檢出限低、前處理簡單、精密度和重復(fù)性好等優(yōu)點，適用于藍莓等漿果中氟啶蟲酰胺和溴氰蟲酰胺的監(jiān)測。