糌粑中β-葡聚糖、總多酚、總黃酮檢測及分析

扎西窮達，劉吉愛，王軍

1. 西藏自治區食品藥品檢驗研究院（拉薩 850000）；2. 中國農業大學食品科學與營養工程學院（北京 100083）

糌粑是用青稞炒熟后磨成粉狀，是西藏傳統特色食品。糌粑營養豐富，風味獨特，在缺少瓜果蔬菜的高寒地區的人民經常食用，可解決人體營養缺乏癥。對糌粑營養成分研究的相關報道較少，特別是對不同糌粑中關鍵營養功能指標的分析。糌粑作為藏區人民食用的重要主食之一，不僅為使用者提供能量（熱量），還能提供提高免疫力等作用的功能因子，針對糌粑具有降血脂、降血糖、抗氧化、抗癌等輔助功效[1]，分別選取β-葡聚糖，總多酚、總黃酮進行檢測和分析。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

自制白糌粑、偏黑糌、水磨白糌粑、加豌豆糌粑、黑糌粑（購于西藏拉薩小昭寺附近）。

1.2 儀器與試劑

1.2.1 儀器與設備

超純水儀（PURIST，上海樂楓生物科技有限公司）；分析天平（AL204-IC，感量0.000 1 g，梅特勒-托利多儀器有限公司）；紫外分光光度計（TU-1810D，北京普析通用儀器有限責任公司）；離心機（TDL-40B，3 500 r/min，上海安亭科學儀器廠制造）。

1.2.2 對照品和試劑耗材

蘆丁（純度＞99%）；沒食子酸（純度＞99%）；葡萄糖（純度＞99%）；九水合硝酸鋁；亞硝酸鈉；無水乙醇；Folin-Ciocalteu（FC）試劑；Megazyme混聯β-葡聚糖測定試劑盒；碳酸鈉；氫氧化鈉；冰乙酸；磷酸二氫鈉；三水乙酸鈉；超純水（除另有說明外，所有試劑均為分析純，水符合GB/T 6682規定的三級水要求）。

1.3 試驗方法

1.3.1 黃酮含量測定[2]

1.3.1.1 儀器參考條件

檢測波長510 nm。

1.3.1.2 分析步驟

1.3.1.2.1 標準曲線的配制

標準溶液儲備液（0.15 mg/mL）配制：精密稱取15 mg蘆丁，用30%乙醇溶解并定容至100 mL容量瓶中，搖勻備用，即為蘆丁標準溶液。

標準溶液系列配制：取0.050，0.100，0.200，0.400，0.500，0.800，1.00和3.00 mL標準溶液儲備液（0.15 mg/mL），于10 mL比色管中，加入30%的乙醇溶液至5 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，放置5 min后，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，反應6 min，加入2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液后，加水定容至10 mL。得到的標準曲線質量濃度分別為0.000 75，0.001 50，0.003 00，0.006 00，0.007 50，0.012 00，0.015 00和0.045 00 mg/mL。于510 nm波長下測定吸光度，根據測量標準使用液所產生吸光度，求得吸光度與濃度關系的一元線性回歸方程。以質量濃度C（mg/mL）為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準工作曲線。標準曲線：Y=9.166X+0.014 1，R2=0.998 6。

圖1 黃酮標準曲線圖

1.3.1.2.2 試樣制備

糌粑樣品（粉末狀、干燥）取0.4 g樣品加4 mL 80%乙醇，超聲40 min，混勻離心后得到樣品上清液，濾渣進行二次提取，合并2次提取液，并過0.45 μm有機相濾膜，得到提取液（V2）備用。分別吸取1.0 mL上述樣品于10 mL（V1）比色管中，加入30%的乙醇溶液至5 mL，加入0.3 mL 5%亞硝酸鈉溶液，放置5 min后，加入0.3 mL 10%硝酸鋁溶液，反應6 min，加入2 mL 1 mol/L氫氧化鈉溶液后，用超純水定容至刻度線，測定其黃酮含量。以不加反應液的樣品為空白樣品。上機檢測，得到樣品的吸光度A。

式中：A為樣品的吸光度（即Y=9.166X+0.014 1中的Y值）；X為樣品中黃酮含量，mg/g；C為溶液單位質量濃度，mg/mL；V1為定容體積，mL；V2為提取液總體積，mL；m為樣品質量，g。

1.3.2 多酚含量測定[3]

1.3.2.1 儀器參考條件

檢測波長760 nm。

1.3.2.2 分析步驟

1.3.2.2.1 標準曲線的配制

標準溶液儲備液（0.1 mg/mL）配制：取0.011 1 g沒食子酸（1H2O合），于100.00 mL容量瓶中，用超純水定容至刻度線。

標準溶液系列配制：取0.100，0.200，0.500，0.800和1.000 mL標準溶液儲備液（0.1 mg/mL），于10 mL容量瓶中，加入1.00 mL 50%的FC溶液和2.00 mL 15%碳酸鈉溶液，用超純水定容至刻度線，充分混勻后，室溫下避光放置1 h，得到的標準曲線質量濃度分別為0.001，0.002，0.005，0.008和0.010 mg/mL。根據測量標準溶液系列所產生吸光度，求得吸光度與濃度關系的一元線性回歸方程。以質量濃度C（mg/mL）為橫坐標、吸光度為縱坐標，繪制標準工作曲線。標準曲線：Y=129.52X-0.011 2，R2=0.999 8。

圖2 多酚標準曲線圖

1.3.2.2.2 試樣制備及檢測

糌粑樣品（粉末狀、干燥），取0.3 g樣品加4 mL 70%乙醇，超聲30 min，混勻離心后得到樣品上清液，濾渣進行2次提取，合并2次提取液，并過0.45 μm有機相濾膜，得到提取液（V2）備用。分別吸取1.0 mL上述樣品于10 mL（V1）容量瓶中，加入1.00 mL 50%的FC溶液和2.00 mL 15%碳酸鈉溶液，用超純水定容至刻度線，充分混勻后，室溫下避光放置1 h，測定其多酚含量。以不加反應液的樣品為空白樣品。上機檢測，得到樣品的吸光度A。

式中：A為樣品的吸光度（即Y=129.52X-0.011 2中的Y值）；X為樣品中多酚含量，mg/g；C為溶液單位質量濃度，mg/mL；V1為定容體積，mL；V2為提取液總體積，mL；m為樣品質量，g。

1.3.3β-葡聚糖含量分析[4]

1.3.3.1 儀器參考條件

檢測波長510 nm。

1.3.3.2 分析步驟

1.3.3.2.1 試劑的配制

50%乙醇溶液：取50 mL無水乙醇定容至100 mL。

20 mmol/L、pH 6.5磷酸鹽緩沖溶液：稱取3.12 g NaH2PO4·2H2O，加900 mL水溶解，用1 mol/L NaOH溶液調節至pH 6.5，定容至1 000 mL。

200 mmol/L、pH 4.0乙酸鈉緩沖溶液：取7.6 mL冰醋酸于900 mL水中，加入4.8 g三水乙酸鈉溶解，調節至pH 4.0，定容至1 000 mL。

50 mmol/L、pH 4.0乙酸鈉緩沖溶液：取250 mL 200 mmol/L、pH 4.0乙酸鈉緩沖溶液稀釋至1 000 mL。

1.000 mg/mL葡萄糖標準儲存液：將葡萄糖粉末于100 ℃下常溫干燥2 h，室溫冷卻后準確稱取0.100 g干燥葡萄糖，用50 mmol/L、pH 4.0乙酸鈉緩沖溶液溶解并定容至100 mL。

50 U/mL地衣聚糖酶溶液：將Megazyme混聯β-葡聚糖測定試劑盒中的地衣聚糖酶溶液用20 mmol/L、pH 6.5磷酸鹽緩沖溶液稀釋至20.0 mL。

2 U/mLβ-葡萄糖苷酶溶液：將Megazyme混聯β-葡聚糖測定試劑盒中的β-葡萄糖苷酶溶液用50 mmol/L、pH 4.0乙酸鈉緩沖溶液稀釋至20.0 mL。

葡萄糖氧化酶-過氧化物酶-緩沖溶液：將Megazyme混聯β-葡聚糖測定試劑盒中的葡萄糖氧化酶-過氧化物酶混合試劑50 mL稀釋定容至1 000 mL。

1.3.3.2.2 操作步驟

葡萄糖標準工作液：平行移取100 μL葡萄糖標準儲存液至3支試管中，分別添加100 μL 50 mmol/L、pH 4.0乙酸鈉緩沖溶液。

試劑空白：移取200 μL 50 mmol/L、pH 4.0乙酸鈉緩沖溶液至試管中。

樣品稱取：準確稱取0.1～0.5 g（精確至0.000 1 g）待測樣品，至于玻璃試管底部。

酶解前處理：向待測樣品試管中添加0.2 mL 50%乙醇溶液，于渦旋混合儀上振蕩分散；加入4.0 mL磷酸鈉緩沖溶液，充分振蕩后，將試管放入沸水浴中，保持1 min；取出試管，在渦旋混合儀上振蕩數秒；沸水浴中繼續保持2 min，振蕩處理同前。

酶解反應：試管在50 ℃水浴中保溫5 min，添加0.2 mL地衣聚糖酶溶液，混合均勻，室溫下冷卻5～10 min；以4 000 r/min離心10 min，取上清液，備用；分別移取0.1 mL上清液至3支試管底部，向其中2支試管中分別添加0.1 mLβ-葡萄糖苷酶溶液；另一支試管中添加0.1 mL 50 mmol/L、pH 4.0乙酸鈉緩沖溶液，作為反應空白，將上述試管在50 ℃下保溫10 min。

顯色反應：分別移取3.0 mL葡萄糖氧化酶-過氧化物酶-緩沖溶液至各試管（包括2個測試樣、1個反應空白、3個D-葡萄糖標準工作液、1個試劑空白），50℃下反應20 min；取出試管，冷卻至室溫。

比色：以試劑空白調零，于510 nm處測定吸光度。如果試樣中β-葡聚糖濃度大于10%，將產生比100 μL葡萄糖標準工作液高的吸光度。此時，需將備用上清液用適量50 mmol/L、pH 4.0乙酸鈉緩沖溶液稀釋，再進行后續步驟，結果計算時應把稀釋因子考慮在內。

式中：ΔA為樣品吸光度與反應空白吸光度的差值；F為吸光度轉化為μg葡萄糖的轉換因子，F=100 μg葡萄糖/100 μg葡萄糖的吸光度；94為體積校正因子；W為樣品質量，g；0.9為葡萄糖轉化成β-葡聚糖的脫水轉換因子。

計算結果均保留至小數點后2位。

2 結果與分析

2.1 黃酮結果與分析

2.1.1 黃酮含量檢測結果

以青稞為主要原料的糌粑中富含黃酮和各種對人體有益的活性成分。游離黃酮是糌粑中黃酮類物質的主要存在形式，黃酮類化合物具有抗衰老、抗真菌、抗癌、降血脂和保護心腦血管等多種藥理活性[5]。

表1 糌粑中黃酮含量

2.1.2 黃酮含量結果的分析

黃酮是植物中非常重要的具有去自由基、抗氧化等功能的活性物質。以青稞為主要原料的糌粑中富含黃酮和各種對人體有益的活性成分。黃酮類化合物具有抗衰老、抗真菌、抗癌、降血脂等生物活性。對糌粑樣品中的總黃酮含量分析發現，黃酮含量范圍在2.90～6.80 mg/g之間，其中黃酮含量最低的是加豌豆糌粑2.90 mg/g，黃酮含量最高的是黑糌粑6.80 mg/g，見圖3。糌粑中總黃酮和總酚含量豐富，高于小麥粉和豌豆粉，因此添加豌豆粉后其黃酮含量會呈現降低。

圖3 糌粑中黃酮含量

2.2 多酚結果與分析

2.2.1 多酚含量檢測結果

糌粑中含有多酚類物質，包括原花青素類等[6]，酚類物質的種類及含量在不同品種青稞中是不同的，游離的酚類一般為原花青素類和類黃酮。糌粑中富含的青稞多酚類化合物是重要的生物活性成分，具有抗氧化、活血化痰、清除自由基、抗衰老、增強免疫力等多種生理功能[7]。

表2 糌粑中多酚含量

2.2.2 多酚含量結果的分析

糌粑中的多酚類物質，包括原花青素類等，多酚類化合物是重要的生物活性成分，具有抗氧化、活血化痰、清除自由基、抗衰老等生理活性。多酚含量范圍在0.583～1.50 mg/g之間，其中多酚含量最低的是加豌豆糌粑樣品0.583 mg/g，含量最高的是黑糌粑樣品1.50 mg/g，見圖4。黑糌粑中含有花青素類物質，因此黑糌粑中的多酚類物質含量較為突出，這也是黑糌粑的重要特點。

圖4 糌粑中多酚含量

2.3 β-葡聚糖結果與分析

2.3.1β-葡聚糖含量檢測結果

20世紀60年代，研究逐漸發現β-葡聚糖具有降血脂、降膽固醇和預防心血管疾病的作用。β-葡聚糖的調節血糖、提高免疫力、抗腫瘤的作用也陸續被發現，引起全世界的廣泛關注。β-葡聚糖作為一種非淀粉類碳水化合物——食用膳食纖維，本身能量低、糖分低。大量研究表明，富含β-葡聚糖的食品食用后增加腸道黏度、結腸處滲透、不易被人體消化吸收，消化器官中存在β-葡聚糖，可以促進胃腸蠕動，加快有害成分排出體外。β-葡聚糖能夠減緩血液中葡萄糖含量的增加，從而在預防和控制糖尿病方面具有一定的治療效果。用于制作糌粑的主要原料青稞中含有較豐富的β-葡聚糖，對調節血糖、提高免疫力、抗腫瘤具有重要價值，分析糌粑中β-葡聚糖的含量對區分和評價糌粑的品質具有重要參考作用[8]。

表3 糌粑中β-葡聚糖含量

2.3.2β-葡聚糖含量結果的分析

β-葡聚糖作為一種非淀粉類碳水化合物——食用膳食纖維，本身能量低、糖分低。富含β-葡聚糖的食品食用后增加了腸道黏度、結腸處滲透、不易被人體消化吸收，可以促進胃腸蠕動，加快有害成分排除體外。β-葡聚糖能夠減緩血液中葡萄糖含量的增加，對調節血糖、提高免疫力、抗腫瘤具有一定作用。對樣品分析發現，糌粑樣品中β-葡聚糖含量范圍在0.03%～5.98%之間（見圖5），高于小麥粉、大米粉、豆粉等。因此添加豌豆的糌粑中含量最低，為 0.03%，而自制白糌粑由于精制工藝較少，其中含量較高，在分析的樣品中自制白糌粑中的含量達5.98%，說明只用青稞制為原料，并且精制工序較少的糌粑中葡聚糖含量較高。β-葡聚糖的含量分析對糌粑精制情況、摻雜分析等品質分析都具有一定借鑒作用。

圖5 糌粑中β-葡聚糖含量

3 結論

通過對糌粑樣品中上述一些功能性成分相關的總多酚、總黃酮及β-葡聚糖含量指標檢測及分析，黃酮含量最低的是加豌豆糌粑2.90 mg/g，黃酮含量最高的是黑糌粑6.80 mg/g；多酚含量最低的是加豌豆糌粑樣品0.583 mg/g，含量最高的是黑糌粑樣品1.50 mg/g；β-葡聚糖含量最低的是加豌豆的糌粑，為0.03%，自制白糌粑中的含量達5.98%。糌粑中總黃酮、總多酚和β-葡聚糖含量豐富，高于小麥粉和豌豆粉，因此添加豌豆粉后其黃酮、多酚及β-葡聚糖含量會呈現降低，黑糌粑中含有花青素類物質，因此黑糌粑中的總黃酮類和多酚類物質含量較為突出，這也是黑糌粑的重要特點，而自制白糌粑由于精制工藝較少，β-葡聚糖含量較高，說明只用青稞制為原料，并且精制工序較少的糌粑中葡聚糖含量較高。試驗結果可有效評價糌粑的品質狀況及摻雜等狀況，對糌粑產品的監測、分析提供參考方法。