超高效液相色譜-電化學檢測法測定石斛中的石斛酚

羅敏 ，顧雯 ，何婷 ，周昌喜 ，淳澤利 ，陳榮祥 *

1．遵義醫科大學分析測試中心（遵義 563000）；2. 遵義醫科大學藥學院（遵義 563000）；3. 遵義市理化分析測試工程技術研究中心（遵義 563000）

石斛屬蘭科植物，其種類主要有70多種，如金釵石斛、鐵皮石斛、鼓槌石斛、霍山石斛等，藥用部位為新鮮品或干燥的根莖。除藥用外，石斛作為保健食品的使用歷史也有幾千年之久。其中，代表性的品種鐵皮石斛原球莖在2012年被批準為新資源食品，可直接沖泡或加工成飲品飲用[1]。有研究發現石斛具有抗衰老、抗腫瘤、抗炎、抗氧化、抗糖尿病白內障、治療心腦血管疾病、改善胃腸道運動等生理活性[2-4]。近年來，在具藥理活性的40多種石斛中分離出近100種化合物，包括多糖、萜、生物堿、酚、氨基酸、黃酮等[5-7]。其中，天然產物中的酚類化合物具有較強的藥理活性，例如抗氧化、抗炎、抗腫瘤等[8]。石斛酚（Gigantol）是石斛中典型的酚類化合物，有研究表明石斛酚可抑制高糖誘導的氧化應激反應，在糖尿病視網膜病變的發生發展中可能有一定保護作用，可以幫助減少新生血管的生成[9]。石斛酚還可以增強細胞的抗氧化能力并保護高糖損傷的血管內皮細胞[10]，在抗腫瘤方面可以抑制肺癌細胞轉移[11]。因此，石斛酚的水平可以作為衡量石斛品質的重要標志。

然而，對于石斛中石斛酚含量測定方法研究較少，大多采用液相色譜分離，紫外檢測器檢測[12-13]。然而，常規高效液相色譜多采用250 mm色譜柱，分析時間耗時較長，分離效率低。紫外檢測器的檢測靈敏度也較低，對于石斛酚含量較高的樣品來說，比較容易檢測，但是對于低含量的樣本則靈敏度不足，需要采用液相萃取或固相萃取等技術進行富集后檢測。例如，采用分散液-液微萃取技術對鐵皮石斛中的石斛酚進行富集，富集倍數可達27.94倍[12]。然而，復雜的前處理過程將極大增加時間和經濟成本。因而，需要發展一種更靈敏、快速的方法來對石斛中的石斛酚進行測定。

電化學檢測器（ECD）靈敏度極高，同時具有良好的選擇性，在藥品和食品質量控制方面發揮重要的作用[14-15]。酚類化合物的酚羥基活性較強，采用電化學檢測器在直流模式下即可進行檢測，因此酚類物質適合運用電化學檢測器進行檢測[16-17]。在石斛酚結構中，其苯環上有酚羥基和甲氧基，這2個基團在直流模式下很容易發生氧化，直接采用電化學檢測器在氧化模式下即可檢測。同時，采用超高效液相色譜可以縮短分離時間，提高分析效率。因此，試驗擬采用超高效液相色譜結合電化學檢測（UPLC-ECD）建立一種簡單、快速、靈敏的檢測方法，并用于不同品種石斛中石斛酚的測定，為合理評價石斛質量提供依據。

1 材料與方法

1.1 儀器與設備

Ulti Mate 3000 bio-RS超高效液相色譜儀（美國賽默飛），配備ECD-RS 3000電化學檢測器（檢測池為6011庫倫檢測池）和DAD-3400 RS二極管陣列檢測器，工作站為Chromeleon 7.1；SB-5200DT超聲波清洗機（寧波新芝生物科技有限公司）；ME104E/02電子分析天平、FE 28 pH計（梅特勒-托利多儀器有限公司）；Purelab Chorus 2純水超純水系統（英國埃爾格）。

1.2 試驗材料與試劑

乙腈、乙酸銨、冰乙酸（均為色譜純，購自上海阿拉丁生化科技股份有限公司）；石斛酚標準品（中國食品藥品檢定研究院）；金釵石斛（產自廣西、四川）；鐵皮石斛（產自四川、貴州）；實驗室自制超純水。

1.3 標準溶液的配制

標準儲備液：精密稱取石斛酚標準品，加入甲醇溶解，配制成100 mg/L標準溶液，于-20 ℃下儲存備用。

標準工作液：用上述配制好的100 mg/L石斛酚標準品儲備液，加甲醇稀釋，分別配制濃度為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00和10.00 mg/L標準工作液。

1.4 石斛酚提取試驗

將石斛粉碎，過篩，稱取0.05 g樣品粉末，加入一定體積分數的甲醇（50%，60%，70%，80%和90%）進行超聲輔助提取。設置提取時間分別為5，10，20，30和40 min，料液比為1∶50，1∶100，1∶200，1∶300和1∶500（g/mL）。提取液經0.22 μm有機濾膜過濾后進行上機檢測。根據峰面積計算石斛酚的含量，以每克樣品中石斛酚的質量代表提取率。

1.5 色譜條件

色譜柱Waters XBridge BEH C18柱（2.1 mm×150 mm，填料粒徑1.7 μm）；柱溫40 ℃；流動相25 mmol/L乙酸銨溶液（pH 3.6）-乙腈65%∶35%（V/V），流速0.4 mL/min，進樣量1 μL；自動進樣器溫度4 ℃；ECD檢測電壓525 mV；二極管陣列檢測器檢測波長230 nm。

2 結果與分析

2.1 提取條件優化

考察提取時間、提取溶劑以及料液比對石斛中石斛酚提取率的影響，分別對三者進行優化，以獲得最佳的提取條件。

2.1.1 提取溶劑的選擇

酚類化合物通常采用甲醇、乙醇等進行提取，采用甲醇-水提取石斛中的石斛酚。固定料液比1∶300（g/mL）、提取時間10 min，分別用體積分數50%，60%，70%，80%和90%的甲醇進行超聲提取，結果如圖1所示。石斛中石斛酚提取效率隨甲醇體積分數（50%～70%）增大而增加，70%甲醇對石斛酚提取率最高，超過70%時，提取率有所下降，因而選擇體積分數70%的甲醇作為提取溶劑。

圖1 甲醇體積分數對石斛酚提取效率的影響

2.1.2 料液比的影響

采用70%甲醇提取10 min，考察料液比分別為1∶50，1∶100，1∶200，1∶300和1∶500（g/mL）對石斛中石斛酚提取效率的影響，結果如圖2所示。隨著料液比比例減小，石斛中石斛酚的提取率逐漸增大，料液比小于1∶300（g/mL）時，提取率趨于平緩。故采取料液比1∶300（g/mL）作為料液比。

2.1.3 提取時間的選擇

采用70%甲醇，料液比1∶300（g/mL），分別設置提取時間5，10，20，30和40 min，考察不同提取時間對于提取效率的影響，結果見圖3。提取時間超過10 min后，石斛酚提取率幾乎沒有任何變化，且提取率達到最大，故采取10 min作為提取時間。

因此，優化后的最佳提取條件為：采用體積分數70%甲醇作為提取溶劑，料液比1∶300（g/mL），提取時間10 min。

圖2 料液比對石斛酚提取效率的影響

圖3 提取時間對石斛酚提取效率的影響

2.2 色譜條件的選擇及優化

2.2.1 流動相條件的優化

電化學檢測器相比于其他的檢測器有所不同，其在使用時流動相中需要有一定含量的緩沖鹽，通常需要大于20 mmol/L。故試驗采用乙酸銨作為流動相添加劑，通過調節有機相的比例以及流動相的pH改善分離。采用pH 7.0乙酸銨溶液時，石斛酚拖尾較為嚴重。加入冰乙酸后峰形顯著改善，然而過低的pH導致電化學檢測器的響應降低。綜合考慮，選擇乙酸銨溶液（pH 3.6）-乙腈65%∶35%作為流動相。在此條件下，石斛酚能與其他雜質完全分離開，且總分析時間較短，峰形對稱。

2.2.2 檢測電壓的選擇

在優化的流動相條件下，將檢測池的電壓由0 mV逐漸升高至550 mV，將同一份樣品重復進樣，考察不同檢測電壓下石斛酚峰面積的變化，以確定最佳的檢測條件，結果見圖4。電壓低于250 mV時，石斛酚幾乎沒有氧化；電壓500 mV時，石斛酚氧化完全，繼續增大電壓石斛酚的峰面積增加緩慢，而噪音快速增加。故選擇525 mV作為石斛酚的檢測電壓。

圖4 不同檢測電壓下石斛酚的峰面積變化

2.3 色譜圖和標準曲線

準確移取不同體積的石斛酚標準品儲備液（100 mg/L），加甲醇稀釋，分別配制質量濃度為0.10，0.20，0.50，1.00，2.00，5.00和10.00 mg/L標準溶液，按照優化后的色譜條件進行檢測，以峰面積y（nA·min）作為縱坐標，樣品質量濃度x（mg/L）作為橫坐標，繪制標準曲線。石斛酚的回歸方程為y=13.425x+0.177，線性相關系數R2=0.999 6；結果表明，石斛酚在0.1～10 mg/L范圍內與峰面積呈良好的線性關系。按3倍信噪比計算檢出限為0.8 μg/L，石斛樣品中石斛酚方法檢出限為0.24 mg/kg。在優化后的分離和檢測條件下，石斛酚標準品色譜圖見圖5。

圖5 石斛酚標準品色譜圖

2.4 精密度、穩定性和回收率考察

取同一份石斛提取液在上述色譜條件下連續進樣6次，對其進行精密度考察，記錄石斛酚的峰面積并計算RSD值，為1.90%。結果表明該方法精密度良好。

石斛酚具有較強的還原性，在室溫下放置極易被氧化。取同1份供試品溶液，將自動進樣器溫度設置為4 ℃，對其重復進樣記錄峰面積的變化情況。結果表明，12 h內，石斛酚的峰面積隨其時間變化比較穩定，相對標準偏差為0.39%，證明石斛酚在4 ℃下具有較好的穩定性。

稱取已知石斛酚含量的石斛樣品，按照400，800和1 600 mg/kg進行加標回收試驗，每個加標濃度平行操作6次，計算回收率，結果見表1。不同加標水平的回收率在97.53%～103.24%之間，相對標準偏差（RSD）小于5%，說明方法準確可靠。

表1 石斛酚的加標回收率結果（n=6）

2.5 樣品測定

在優化的提取條件和色譜條件下，分別對不同產地的鐵皮石斛、金釵石斛中的石斛酚進行測定，檢測結果見表2。結果顯示，所有石斛樣品中均可檢出石斛酚，其含量介于51.7～800.2 mg/kg之間。實際樣品的色譜圖見圖6。

圖6 石斛樣品色譜圖（A，金釵石斛；B，鐵皮石斛）

表2 不同石斛中石斛酚含量

2.6 UPLC-ECD與其他方法的比較

制備同一份石斛提取液，按照優化的色譜條件分別用UPLC-ECD與UPLC-DAD對其進行含量測定。除檢測器之外的其他條件均相同，結果如圖7所示。同一樣品在UPLC-ECD上響應較好，信噪比高。而采用UPLC-DAD檢測，石斛酚的信號響應低于儀器檢出限，無法檢出。

圖7 UPLC-ECD（A）與UPLC-DAD（B）檢測同一樣品的色譜圖比較（料液比1∶300 g/mL）

按照料液比1∶20（g/mL），采用70%甲醇超聲提取，制備高濃度的石斛酚提取液，并按照優化后的色譜條件分別采用UPLC-ECD與UPLC-DAD進行測定，結果如圖8所示。該樣品中的石斛酚采用ECD和DAD檢測器均可檢出，但二者的信噪比差別顯著。ECD響應較好，信噪比高，靈敏度遠高于DAD。盡管該條件下DAD可檢出石斛酚，但之前的提取條件優化表明1∶20（g/mL）的料液比無法有效提取石斛酚，其檢測結果與真實值差異較大。因而，相對于DAD，采用ECD檢測石斛酚有明顯的優勢，對于含量較高的樣品，在實際檢測過程中可以采用稀釋后進樣，減少樣品中弱極性組分在色譜柱中的殘留，色譜柱的污染程度大幅降低，延長色譜柱壽命，減少檢測成本。

對于石斛酚含量較低的石斛樣品，該方法的優勢更為突出。有文獻表明鐵皮石斛中石斛酚含量非常低[18]，也有文獻采用HPLC檢測金釵石斛中石斛酚，結果含量甚微[19]。可見不同品種、不同產地的石斛中石斛酚差異很大，采用此次試驗建立的方法，所檢測的樣品中的石斛酚均可檢出，且信噪比較好，靈敏度高。

近年來，隨著液相色譜-串聯質譜的發展，有文獻采用該方法對石斛中的石斛酚、有機酸、黃酮等成分進行測定。例如，采用正離子多反應監測（MRM）模式對石斛酚進行測定，檢出限可達0.2 μg/L[20]。方法采用電化學檢測器，檢出限與串聯質譜在同一數量級（方法為0.8 μg/L），同串聯質譜法相比，方法的儀器設備使用成本較低，且操作簡單，無需考慮不同樣本間基質效應的差異問題。

圖8 UPLC-ECD（A）與UPLC-DAD（B）檢測同一樣品的色譜圖比較（料液比1∶20 g/mL）

3 結論

通過對石斛中石斛酚的提取條件、液相色譜的分離條件和檢測條件進行優化，建立UPLC-ECD對不同品種的石斛中石斛酚含量的檢測方法。將ECD檢測器同光學檢測器進行比較。結果表明該方法前處理簡單快捷、分離快速、靈敏度和準確度高，能夠滿足不同品種石斛中石斛酚的檢測要求。