LC-MS/MS測定新鮮水果蔬菜中LAE的方法

郝志闊，賈洪信，楊晉青

1. 廣東環(huán)境保護工程職業(yè)學(xué)院食品工程系（佛山 528216）；2. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗技術(shù)研究院（上海 200233）

月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽（ethyl lauroyl arginate hydrochloride，LAE）是一種新型食品防腐劑，對革蘭氏陽性菌、革蘭氏陰性菌、酵母和霉菌都具有明顯的抑制作用，具有廣譜抗菌性[1-3]。研究表明LAE具有極好的安全性，在人體內(nèi)通過化學(xué)和代謝途徑水解為人體日常飲食中攝入的化合物[4-5]。2005年，LAE被美國FDA列為一般公認安全（GRAS）的食品添加劑，推薦添加量為200 mg/kg，允許用于肉類和禽類食品[6]。2007年，LAE通過歐洲食品安全管理局（EFSA）的安全食品認證。2011年，LAE被國際食品法典委員會列入《食品添加劑通用法典標準》中，可廣泛用于多種食品及生鮮農(nóng)產(chǎn)品[7]。2012年，澳大利亞批準LAE作為防腐劑使用在香腸和香腸肉（包括未加工的肉類原料）中，最大使用量為315 mg/kg[8-9]。根據(jù)我國衛(wèi)健委《食品添加劑新品種管理辦法》規(guī)定，2018年05月11日國家食品安全風險評估中心發(fā)布關(guān)于《食品添加劑 Na-月桂酰-L-精氨酸乙酯鹽酸鹽》的征求意見，主要包含食品添加劑申請者提交的申請資料中可公開征求意見的內(nèi)容，內(nèi)容規(guī)定了新鮮水果和新鮮蔬菜的最大使用量為220 mg/kg。目前月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽尚未被列入GB 2760《食品添加劑使用標準》中，因此沒有相應(yīng)的食品添加劑月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標準及其標準[10-11]。鑒于此，試驗以新鮮水果和新鮮蔬菜為研究對象，利用高效液相色譜法檢測其中的防腐劑LAE含量，以期建立一種快速高效的新鮮水果和蔬菜中防腐劑LAE含量的檢測方法，為食品添加劑質(zhì)量規(guī)格標準和檢測方法標準提供技術(shù)支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料與試劑

乙腈、甲醇（色譜純，賽默飛世爾科技（中國）有限公司）；月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標準品：USP，美國藥典委員會。

月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標準儲備液（1.0 mg/mL）：稱取0.100 0 g月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽于100 mL容量瓶中，用V（水）∶V（乙腈）=1∶9溶解并定容至刻度，存放于4 ℃冰箱中備用。月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標準工作液：取1.0 mL月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標準儲備液用V（水）∶V（乙腈）=1∶9溶劑稀釋至1.0 mg/L備用。

月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標準校正溶液：用V（水）∶V（乙腈）=1∶9溶劑稀釋月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽標準工作液，使其質(zhì)量濃度分別為20，10，5，1，0.2和0.1 μg/L。

1.1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290液相色譜儀（美國安捷倫科技公司）；AB SCIEX QTRAP?6500質(zhì)譜儀（美國Sciex公司）；TB-114型分析天平（Mettler Toledo公司）；渦旋混合器（德國IKA公司）；超聲波清洗器（上海鯨德公司）；高速離心機（Eppendorf公司）；氮氣濃縮裝置（英國PEAK公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜條件

色譜柱Waters ACQUITY UPLC?BEH C18（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）；流動相為0.1%甲酸水溶液和乙腈，梯度洗脫；流速為300 μL/min；柱溫為30℃；進樣體積為2 μL。

質(zhì)譜條件：離子化方式，ESI；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；氣簾氣（CUR），20.0 psi；霧化氣（GS1），35.0 psi；加熱氣（GS2），30.0 psi；噴霧電壓（IS），5 500 V；去溶劑溫度（TEM），450 ℃；去簇電壓（DP）=30 V；定量離子對385.3/368.3，碰撞能（CE）=28 eV；定性離子對385.3/326.3，碰撞能（CE）=31 eV。

1.2.2 樣品前處理條件

準確稱取2.50 g試樣于50 mL離心管中，加入25.0 mL乙腈，2 g氯化鈉，渦旋1 min，超聲5 min，以9 000 r/min離心1 min，上清液經(jīng)0.22 μm濾膜過濾，濾液作為待測溶液。

2 結(jié)果與分析

2.1 質(zhì)譜方法

使用1 μg/mL濃度的LAE標準溶液，通過流動注射泵進入質(zhì)譜進行母離子和子離子掃描優(yōu)化，離子化方式，ESI；掃描方式，正離子掃描；檢測方式，多反應(yīng)監(jiān)測（MRM）；氣簾氣（CUR），20.0 psi；霧化氣（GS1），35.0 psi；加熱氣（GS2），30.0 psi；噴霧電壓（IS），5 500 V；去溶劑溫度（TEM），450℃；優(yōu)化得到LAE的母離子、子離子及碰撞能量等質(zhì)譜采集參數(shù)如表1所示，其中385.3/368.3為定量離子。

表1 質(zhì)譜采集參數(shù)

2.2 液相色譜方法

使用10 ng/mL的LAE標準溶液進行液相色譜質(zhì)譜方法優(yōu)化，分別使用甲醇- 質(zhì)量分數(shù)0.1%甲酸水和乙腈-質(zhì)量分數(shù)0.1%甲酸水作為流動相進行梯度洗脫，洗脫梯度如表2所示，其中A相為質(zhì)量分數(shù)0.1%的甲酸水溶液，B相為有機相，得到的圖譜如圖1和圖2所示。

從圖1和圖2可以看出，乙腈的洗脫能力好于甲醇，質(zhì)譜響應(yīng)高于甲醇，且色譜峰較窄，故選擇乙腈-質(zhì)量分數(shù)0.1%的甲酸水溶液作為LAE檢測的流動相。

表2 梯度洗脫條件

圖1 甲醇梯度洗脫色譜圖

圖2 乙腈梯度洗脫色譜圖

2.3 樣品前處理方法

2.3.1 提取溶劑的選擇

由于LAE易溶于水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯等有機溶劑，所以分別選擇水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯分別作為提取溶劑，考察了這4種不同提取溶劑對新鮮水果和蔬菜中LAE的提取效果。本試驗選取新鮮蘋果為基質(zhì)樣品，將樣品粉碎成漿狀，稱取2.5 g試樣并向其中加入10 μg/kg的LAE標準品，分別選用水、甲醇、乙腈、乙酸乙酯作為提取溶劑，然后對其進行超聲提取相同時間，重復(fù)測定6次，考察提取效率，結(jié)果見表3。

表3 不同提取溶劑對蘋果中LAE的提取效率

4種提取溶劑均能提取蘋果中LAE。水對于LAE提取效率較差，提取不完全，乙腈和乙酸乙酯的提取效率明顯優(yōu)于甲醇，而且乙酸乙酯提取后不能直接過濾上機，涉及到濃縮換溶的問題，不便于前處理過程；而且考察結(jié)果的精密度乙腈明顯高于甲醇和乙酸乙酯，因此本文選擇乙腈作為最終的提取溶劑。

2.3.2 超聲時間和溫度的選擇

超聲提取時間是對測定結(jié)果影響較大的因素之一，因此選取了不同的超聲時間進行了試驗。分別選取了5，10，15，20和30 min，在相同條件下進行分析測定，試驗結(jié)果如表4所示，試驗結(jié)果表明當超聲提取時間為15 min后，提取效果不再提高。所以，最終選擇最佳超聲提取時間為15 min。

表4 不同提取時間對樣品提取效率的影響

此外，還考察了溫度對提取效率的影響。分別選取了25，30和50 ℃ 3個不同溫度點，在相同條件下對試樣進行測定，試驗結(jié)果表明3種超聲溫度下，提取效果基本相同，都能夠滿足測定要求。因此，超聲溫度沒有特別要求。

2.3.3 線性范圍與檢出限

準確移取0.01，0.02，0.1，0.5，1.0和2.0 mL標準儲備液（0.1 mg/L）分別置于10 mL容量瓶中，用乙腈定容。各取2 μL分別按上述色譜-質(zhì)譜條件進行分析。以相應(yīng)的色譜峰面積（y）為縱坐標、待測組分的質(zhì)量濃度x（μg/L）為橫坐標，繪制標準工作曲線，經(jīng)線性回歸后求得相關(guān)系數(shù)。所得結(jié)果見表3。結(jié)果表明待測組分在該濃度范圍內(nèi)均具有良好的線性關(guān)系。

表5 線性范圍

根據(jù)檢出限定為響應(yīng)信號為噪音的3倍（S=3N）時所需的樣品量。定量限定義為響應(yīng)值為10倍基線噪音時所需的樣品量。當取樣量為2.50 g，將一定濃度的LAE標樣添加在空白基質(zhì)樣品中，定容體積為25.0 mL，在相同檢測條件下進樣6針，按檢出限的定義分析數(shù)據(jù)如表6所示。LAE的檢出限為1.0 μg/kg，定量限為3.0 μg/kg。

表6 檢出限結(jié)果

2.3.4 方法回收率和精密度

試驗選取2種有代表性的陰性空白樣品基質(zhì)（蘋果、青椒），分別添加低、中、高3個濃度水平（1.0，2.0和10.0 μg/kg），每一個添加水平重復(fù)測定6次測定，其回收率和精密度結(jié)果如表7所示。從表7中可以看出，回收率范圍在GB 27404—2008標準規(guī)定的60%～120%之間，且相對標準偏差（RSD）＜10%，能夠滿足試驗要求。

表7 回收率和精密度試驗結(jié)果（n=6）

2.3.5 市售樣品分析

取空白基質(zhì)樣品30個，按照樣品處理方法對樣品處理，根據(jù)儀器分析方法，對樣品中的LAE上機分析，樣品中均未檢出月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽，可能是由于目前我國還缺乏此添加劑的產(chǎn)品標準和方法標準，國內(nèi)生產(chǎn)銷售的新鮮水果和蔬菜沒有用其防腐保鮮。

3 結(jié)論

研究建立了一種測定新鮮水果和蔬菜中月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽含量的液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜方法，此方法檢出限低、分析時間短，能夠高效準確的測定新鮮水果和蔬菜中月桂酰精氨酸乙酯鹽酸鹽的含量，希望能夠為今后檢測標準的開發(fā)提供一定的技術(shù)支撐。