鞣花酸柔性納米脂質體的制備工藝優化與體外透皮實驗

林琪, 張嘉穎, 吳振, 陳燕江, 王立強

(1. 華僑大學 生物醫學學院，福建 泉州 362021; 2. 廈門大學 藥學院，福建 廈門 361102; 3. 晏容美業集團有限公司，福建 廈門 361012)

鞣花酸(EA)是一類天然多酚二內酯，是沒食子酸的二聚衍生物，存在于多種水果、堅果、蔬菜和中藥材中.研究表明，鞣花酸具有多種藥理活性，包括抗氧化[1-2]、抗炎[3-5]、抗病毒、抗腫瘤[6]、抗纖維化[7]和化學預防[8]等作用，除此之外，鞣花酸還具有美白清除自由基、抗皺等活性[9]，因此，被廣泛地應用于護膚品中[10].然而，水溶性差、溶液穩定性差[11]、透皮滲透性差[12]等缺點使鞣花酸的應用受到了限制，這些缺點亟待解決.

角質層是皮膚的最外層，是透皮吸收需要克服的最重要的屏障[13].目前，促進透皮吸收的方法有磁導入、電致孔、微針和納米藥物載體等[14-15].近年來，納米藥物載藥已成為極具前景的透皮給藥方式.柔性納米脂質體(FNL)是第二代脂質體，由磷脂和膜柔軟劑(如膽酸鈉、去氧膽酸鈉、吐溫-80、吐溫-20等)組成，結構與生物膜相似.柔性納米脂質體是一種多功能的靶向藥物載體，與傳統脂質體相比，其具有高度變形性，可促進藥物進入皮膚表皮層和真皮層，將大部分的藥物留在皮膚中，減少進入人體血液循環的藥物量，在表皮和真皮形成藥物庫，形成緩釋模型，使藥物在局部持久治療[16-17].柔性納米脂質體的透皮遞送機制一般認為是以水合梯度為驅動力，借助自身的變形能力，穿過比自己粒徑小得多的皮膚孔道，進入表皮層或真皮層[18-19].本文運用Box-Behnken效應面法進行處方優化，利用FNL技術對EA進行藥學修飾，提高EA的皮膚滲透率及藥物穩定性.

1 實驗部分

1.1 實驗儀器

1200型高效液相色譜儀(圖像二極管陣列(DAD)檢測器，美國安捷倫公司)；紫外可見分光光度計(日本島津公司)；電子天平(德國賽多利斯科學儀器有限公司)；恒溫水浴鍋(上海躍進醫療器械廠)；磁力加熱攪拌器(江蘇省金壇市友聯儀器研究所)；NanoBrookomi型多角度納米粒度與高靈敏度Zeta電位分析儀(美國布魯克海文儀器公司)；JEM-1200EX型透射電子顯微鏡(日本電子株式會社)；旋轉蒸發儀、超聲波清洗儀(河南省鞏義市予華儀器有限責任公司)；RYJ-6B型藥物透皮擴散試驗儀(上海黃海藥檢儀器有限公司).

1.2 實驗材料

SD大鼠(雄性大鼠，體質量約200 g，購自福建醫科大學實驗動物中心)；PC-98T型蛋黃卵磷脂(上海市艾偉拓醫藥科技有限公司)、鞣花酸(質量分數為98%，上海市源葉生物科技有限公司)、膽固醇(質量分數≥95%，上海Adamas-beta公司)、甲醇(色譜級，廣東省汕頭市西隴化工股份有限公司)，其余試劑均為市售分析純.

2 實驗方法與結果分析

2.1 鞣花酸的體外分析方法

2.1.1 紫外吸收波長的測定 以甲醇作為空白對照，對質量濃度為10 μg·mL-1的鞣花酸溶液進行200～400 nm波長范圍內的全波長掃描，記錄掃描圖譜，最大吸收波長為255 nm.

2.1.2 高效液相色譜的條件 色譜柱為Sino Chrom ODS-BP(4.6 mm×150.0 mm，5 μm)； 流動相為甲醇-磷酸溶液(V(甲醇)∶V(磷酸)=55∶45，磷酸的體積分數為0.1%)；檢測波長為255 nm；流速為1 mL·min-1；進樣量為30 μL.

2.1.3 系統適應性實驗 取溶劑甲醇溶液(空白溶劑)、鞣花酸甲醇溶液(5 μg·mL-1，鞣花酸對照品)及鞣花酸柔性納米脂質體(EA-FNL)進樣分析，其高效液相色譜(HPLC)圖譜，如圖1～3所示.圖1～3中：S為電信號；t為色譜柱流出物的流出時間.

圖1 空白溶劑的HPLC圖譜 圖2 鞣花酸對照品的HPLC圖譜 Fig.1 HPLC chromatograms of blank solvent Fig.2 HPLC chromatograms of ellagic acid reference

圖3 EA-FNL的HPLC圖譜Fig.3 HPLC chromatograms of EA-FNL

2.1.4 標準曲線的制備 精密稱取10.0 mg鞣花酸，用甲醇溶液溶解并定容于100 mL，配制成0.1 mg·mL-1的鞣花酸對照品儲備母液.稀釋母液，得到質量濃度分別為1,2,3,4,5,6,8,10,30 μg·mL-1的系列對照品溶液，并進樣分析.測定鞣花酸的峰面積，作為縱坐標(y)，以鞣花酸質量濃度為橫坐標(x)進行線性回歸，得到線性回歸方程y=331.79x-186.34，相關系數R2=0.999 1，線性范圍為1～30 μg·mL-1.

2.1.5 精密度實驗 制備質量濃度為5 μg·mL-1的鞣花酸供試品溶液，并進樣分析，連續進樣6 次，測定保留時間與峰面積，其相對標準偏差(RSD，n=6)分別為0.19%，0.17%，精密度良好.

2.1.6 重復性實驗 平行配制6份質量濃度為5 μg·mL-1的鞣花酸供試品溶液，并進樣分析，測定其峰面積，RSD為1.64%(n=6)，重復性良好.

2.1.7 回收率實驗 精密量取1.0 mL空白脂質體混懸液置于10 mL容量瓶中，加入適量鞣花酸樣品儲備液，配置成質量濃度分別為3，5，10 μg·mL-1的低、中、高3組回收率供試品溶液，每組平行配置3份，分別用甲醇定容至刻度，混勻、過濾，并進樣分析，根據回歸方程計算出質量濃度，結果表明，回收率為98.75%～102.34%，RSD為0.95%.

2.1.8 日內穩定性實驗 制備質量濃度為5 μg·mL-1的鞣花酸供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 h進樣分析，無其他雜質產生，RSD為1.87%(n=5)，供試品溶液的日內穩定性良好.

2.1.9 日間穩定性實驗 配制質量濃度為5 μg·mL-1的鞣花酸供試品溶液，分別于0，1，2，3 d進樣分析，無其他雜質產生，RSD為0.91%(n=4)，供試品溶液的日間精密度良好.

2.2 EA-FNL的制備與包封率的計算

2.2.1 EA-FNL的制備 取處方量的卵磷脂、膽固醇、鞣花酸置于茄形瓶內，用10 mL甲醇與三氯甲烷(體積比為4∶1)超聲1 min溶解，于25 ℃下旋蒸30 min，除掉有機溶劑，直至瓶壁上形成薄膜，真空干燥箱2 h，除去殘余有機溶劑，加40 mL磷酸緩沖液(pH=7.0)，水化2 h，過0.22 μm針式濾膜，振搖混勻，即得EA-FNL，于4 ℃下保存備用.

2.2.2 包封率的計算 取制備好的1 mL EA-FNL置于10 mL容量瓶，加入甲醇破乳定容，超聲15 min后，過0.45 μm濾膜，測定鞣花酸總質量濃度(ρt).另取1 mL EA-FNL置于30 ku的超濾離心管，于4 000 r·m-1下離心20 min，取濾過液置于10 mL容量瓶，甲醇定容，超聲15 min后，過0.45 μm濾膜，測定鞣花酸質量濃度(ρy).

EA-FNL包封率(δE)的計算公式為

2.3 EA-FNL制備的影響因素考察

通過單因素實驗來考察表面活性劑的種類、卵磷脂與表面活性劑的質量比、卵磷脂與膽固醇的質量比、藥物質量濃度、水化時間對包封率和粒徑(φ)的影響，再通過Box-Behnken 響應面法優化預測最佳處方.5種單因素對EA-FNL包封率和粒徑的影響,如圖4所示.

(a) 表面活性劑的種類

(b) 卵磷脂與表面活性劑的質量比 (c) 卵磷脂與膽固醇的質量比

(d) 藥物質量濃度 (e) 水化時間 圖4 5種單因素對EA-FNL包封率和粒徑的影響Fig.4 Effects of five single factors on EA-FNL encapsulation efficiency and particle size

2.3.1 表面活性劑的種類 固定鞣花酸質量濃度為25 μg·mL-1，水化時間為3 h，卵磷脂與表面活性劑質量比為4∶1，卵磷脂與膽固醇的質量比為4∶1，設定表面活性劑種類分別為吐溫-80、膽酸鈉、吐溫-20，按照節2.2.1方法制備脂質體，測定其包封率及粒徑，結果如圖4(a)所示.由圖4(a)可知：使用吐溫-20制備脂質體的質量最佳，包封率最大，粒徑最小.這可能是由于吐溫-20具有豐富的親水基團，使水化過程更加容易.

2.3.2 卵磷脂與表面活性劑的質量比 固定鞣花酸的質量濃度為25 μg·mL-1，水化時間為3 h，表面活性劑為吐溫-20，卵磷脂與膽固醇的質量比為4∶1，設定卵磷脂與表面活性劑的質量比(m(卵磷脂)∶m(吐溫-20))分別為1∶1，2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，按照節2.2.1方法制備脂質體，測定其包封率及粒徑，結果如圖4(b)所示.由圖4(b)可知：當卵磷脂與吐溫-20的質量比為1∶1時，所得粒徑最小；當卵磷脂與吐溫-20的質量比為1∶1，2∶1，4∶1時，包封率無顯著性變化.考慮到表面活性劑過多會形成膠束[20]，故后續實驗卵磷脂與吐溫-20的質量比采用4∶1.

2.3.3 卵磷脂與膽固醇的質量比 固定鞣花酸質量濃度為25 μg·mL-1，水化時間為3 h，表面活性劑為吐溫-20，卵磷脂與吐溫-20的質量比為1∶1，設定卵磷脂與膽固醇的質量比(m(卵磷脂)∶m(膽固醇))分別為2∶1，4∶1，6∶1，8∶1，10∶1，12∶1，0∶1，按照節2.2.1方法制備脂質體，測定其包封率及粒徑，結果如圖4(c)所示.由圖4(c)可知：當卵磷脂與膽固醇的質量比為8∶1時，所得包封率最大，粒徑最??；隨著膽固醇比例的增加，粒徑逐漸減小，但超過一定質量比，包封率下降，這可能是由于膽固醇的增加導致膜的通透性增加，使包裹的鞣花酸滲出[21].

2.3.4 藥物質量濃度 固定水化時間為3 h，表面活性劑為吐溫-20，卵磷脂與吐溫-20的質量比為1∶1，卵磷脂與膽固醇的質量比為8∶1，同時，設定鞣花酸的質量濃度(ρ)分別為15，20，25，30，35，40，45 μg·mL-1，按照節2.2.1方法制備脂質體，測定其包封率及粒徑.當鞣花酸質量濃度大于35 μg·mL-1時，第二天溶液會發生聚沉現象，故對15，20，25，30 μg·mL-14個質量濃度進行整理，結果如圖4(d)所示.為保證所得包封率最大，載藥最多，選擇鞣花酸質量濃度為25 μg·mL-1.

2.3.5 水化時間 固定其他因素不變，考察水化時間(th)分別為1，2，3，4 h時，包封率和粒徑的變化情況，如圖4(e)所示.由圖4(e)可知：當水化時間為2 h時，包封率最大.考慮到水化為1 h時，茄形瓶上的薄膜未被完全水化為脂質體；當水化時間為3，4 h時,脂質體的結構被破壞，導致鞣花酸泄露；水化時間超過2 h后，粒徑未有明顯變化,故選擇2 h為最優水化時間.

2.4 Box-Behnken 響應面法優化試驗設計

單因素考察實驗選取卵磷脂與膽固醇的質量比(A)、脂質體制備水化時間(B)、卵磷脂與吐溫-20的質量比(C)作為對EA-FNL包封率影響較大的3個因素，并以鞣花酸的包封率(Y)為響應值，采用Box-Behnken響應面優化制備工藝.每個因素設置3個水平分別為低(-1)、中(0)、高(+1)，各因素水平，如表1所示.

2.4.1 回歸模型的建立與方差分析 以包封率為指標，采用軟件Design-Expert 8.0.6對數據(表2)進行方程擬合，由此得Y=(72.00-0.34A+1.51B-5.84C-2.84AB-0.067AC-1.13BC-6.56A2-13.31B2-2.04C2)/100，R2=0.982 5，P<0.05，擬合度良好.

對模型進行回歸分析與顯著性分析，結果如表3所示.失擬合F值為0.21，失擬合F值相對于純誤差不具有統計學意義，說明實驗結果可靠.方程中C項具有高度統計學意義，說明影響脂質體包封率的最主要因素是卵磷脂與吐溫-20的質量比.

表2 Box-Behnken設計與試驗結果

表3 包封率回歸模型方差分析

2.4.2 響應面優化與預測 運用軟件繪制三因素對評價指標的三維響應面圖，結果如圖5所示.由圖5可知：等高線趨于橢圓，三維圖的曲線較陡，說明兩因素交互作用的顯著性越好；A與B的響應面的曲面較陡，B與C，A與C的響應面的曲面較平坦，說明卵磷脂與膽固醇的質量比與脂質體制備水化時間的交互作用對脂質體包封率的影響最大，欲使包封率最大化，應選擇曲面最高點對應的水平最佳處方工藝，即卵磷脂與膽固醇的質量比為7.83∶1,脂質體制備水化時間為2.1 h,卵磷脂與吐溫-20的質量比為2∶1，預測包封率為75.93%.

(a) A，B交互作用的響應面圖 (b) A，B交互作用的等高線圖

(c) A，C交互作用的響應面圖 (d) A，C交互作用的等高線圖

2.5 EA-FNL的粒徑與Zeta電位

根據最終處方平行制備3組EA-FNL，測定其脂質體包封率、粒徑與電位，測得柔性納米脂質體包封率為(75.66±0.40)%，粒徑為(178.60±4.59) nm，聚合物分散性指數(PDI)為0.15±0.01，電位為(-30.60±0.92) mV.根據透射電鏡圖可知脂質體呈球形，其粒徑大小與激光測定儀測定結果相符.EA-FNL的粒徑分布圖及電鏡照片，如圖6,7所示.圖6中：I為強度.

圖6 EA-FNL的粒徑分布圖 圖7 EA-FNL的電鏡照片 Fig.6 Particle size distribution of EA-FNL Fig.7 Electron micrographs of EA-FNL

2.6 初步穩定性考察

按最優工藝制備EA-FNL，對存儲溫度進行考察，將脂質體混懸液分別置于4,25 ℃保存，于0，1，2，3，4，10 d取樣,測定其包封率，觀察其狀態.脂質體在4，25 ℃環境中保存無明顯差異，EA-FNL的穩定性，如圖8所示.圖8中：θ為溫度；ts為采樣時間.由圖8可知：在第10 d，脂質體的包封率略微下降，粒徑稍有變大.

(a) 包封率 (b) 粒徑圖8 EA-FNL的穩定性Fig.8 Stability of EA-FNL

2.7 體外透皮實驗

2.7.1 離體鼠皮的制備 用水合氯醛將SD雄性大鼠麻醉并斷頸處死，取腹部完整皮膚，將毛發用刀片刮凈.然后，用刀片、鑷子剔除皮膚下脂肪組織，將處理好的皮膚，用生理鹽水清洗干凈，浸泡30 min，用濾紙吸干水分，鋪皮，用錫紙包裹，置于-80 ℃冰箱保存，臨用24 h前用生理鹽水解凍.

2.7.2 透皮實驗 采用Franz擴散池法，將鼠皮角質層向上，固定于接收室與供給室之間，擴散池面積為2.2 cm2，體積為6 mL，為了便于直接進行高效液相色譜的測定，以甲醇-生理鹽水為接收液(V(甲醇)∶V(生理鹽水)=50∶50)，將2 mL EA-FNL加入供給室，控制溫度為(37.0±0.5) ℃，轉速為400 r·min-1，分別于1，2，3，4，6，8，10，12，24 h取出0.7 mL接收液，并加入0.7 mL新的接收液，取出的接收液過0.22 μm濾膜，按照節2.1.2進行色譜分析，計算累積透皮量Qn并記錄結果(圖9)，Qn的計算公式為

上式中：Vt為接收池體積；ρn為n次取樣點質量濃度；ρn-1為n-1次取樣點質量濃度；Vs為每次的取樣體積；S0為滲透面積.

圖9 EA-FNL的累積滲透量Fig.9 Cumulative release of EA-FNL

實驗結束后，取下鼠皮，將表面殘留藥物擦拭干凈，取透皮處皮膚，剪碎，加入1.0 mL甲醇勻漿，勻漿液轉移至離心管中，渦旋混勻，12 000 r·min-1離心10 min，殘渣用0.5 mL甲醇重提一次，合并兩次上清液，混勻，定容至2 mL[22].進行色譜分析，24 h后EA-FNL的皮膚滯留量為13.77 μg·cm-2.

3 討論

以膽固醇、卵磷脂等為原料，通過薄膜分散法制備EA-FNL，并以包封率為考察指標,研究柔性納米脂質體的最佳制備工藝.由于鞣花酸溶解度低等問題，導致EA-FNL的制備難度較高.脂質體包封率有以下3個影響因素.1) 卵磷脂與膽固醇的質量比.卵磷脂與膽固醇的質量比對脂質體結構及穩定具有重要影響，膽固醇是脂質體膜的重要組成部分，對脂質體的流動性及膜的穩定性具有雙向調節作用，合適的比例有利于增加膜的剛性，提高脂質體包封率[23-24].2) 水化時間.水化時間過短，會導致水化不完全，不能很好地將藥物嵌入脂質體的雙分子層中；水化時間過長，又可能破壞脂質體的結構.3) 卵磷脂與吐溫-20的質量比.卵磷脂與吐溫-20的質量比直接影響脂質體的形成，過多的表面活性劑可形成膠束，合適比例的表面活性劑可以減小脂質體粒徑，但表面活性劑成膜性較差，其用量直接影響脂質體的穩定性[25].

經過單因素實驗和Box-Behnken 響應面優化最終確定的EA-FNL最佳處方：卵磷脂與膽固醇的質量比為7.83∶1，脂質體制備水化時間為2.1 h，卵磷脂與吐溫-20的質量比為2∶1.按最佳處方制備EA-FNL，其穩定性仍有待提高，可增加影響因素的考察，例如，水化溫度、攪拌速度、表面活性種類，以及聚乙二醇類等穩定劑[26].

脂質體是一種優秀的藥物載體，具有良好的生物親和性，普通的脂質體不適用于皮膚給藥，難以透過皮膚角質層到達皮膚深層，FNL通過降低雙分子層的界面張力，增加角質層中雙分子層的流動性，從而提高被包裹藥物進入皮膚的通透性[27].通過體外滲透實驗考察EA-FNL的累積透皮量，EA-FNL的透皮率較好，皮膚滯留量較高.今后的工作將進一步考察EA-FNL的穩定性與復配性的問題，并開展動物實驗進行驗證，未來期望將鞣花酸柔性納米脂質體應用于化妝品中，同時，也為柔性納米脂質體作為藥物載體在經皮給藥的應用提供研究思路.