分析Tim-4促進子宮頸癌細胞侵襲與遷移及其相關機制

邢天容

【摘 要】 目的：分析Tim-4促進子宮頸癌細胞侵襲與遷移及其相關機制。方法：使用實時熒光定量PCR法檢測子宮頸上皮永生化細胞系H8和子宮頸癌細胞系Siha中Tim-4的表達水平，用Tim-4的慢病毒載體感染低表達Tim-4的Siha細胞系，觀察癌細胞感染后的Tim-4表達水平，進行細胞遷移侵襲試驗檢測Tim-4對子宮頸癌細胞系Siha的侵襲與遷移能力的影響，最后使用蛋白質印跡法檢測子宮頸癌細胞系Siha中Tim-4和上皮細胞-間充質轉化蛋白的表達。結果：Siha細胞系中Tim-4mRNA表達水平（1.63±0.03）>H8細胞系（0.97±0.06），P<0.05;Tim-4過表達的Siha細胞的穿模數為（102.14±5.14）>空載體（56.34±10.21），P<0.05;蛋白質印跡法結果顯示Tim-4增強了EMT蛋白的表達。結論：Tim-4能夠促進子宮頸癌細胞侵襲與遷移能力，其機制為Tim-4促進了癌細胞中的上皮細胞-間充質轉化（EMT）。

【關鍵詞】 Tim-4;子宮頸;癌細胞侵襲與遷移;Siha細胞

Tim-4全稱T細胞免疫球蛋白黏蛋白-4，是一種新型的免疫調節分子[1-2]。Tim-4主要在巨噬細胞和抗原呈遞細胞中表達，能夠調控巨噬細胞。有研究表明，Tim-4在肺癌中有異常表達的情況，在癌細胞中的表達顯著高于正常組織細胞，且異常表達程度與肺癌的分期和預后呈負相關關系，可以說Tim-4促進了癌細胞的生長和增殖[3]。不過是否與子宮頸癌有關目前未見具體研究，據國內相關文獻報道得知，Tim-4與宮頸癌的侵襲與遷移有關，本文作者為分析Tim-4促進子宮頸癌細胞侵襲與遷移及其相關機制，利用Tim-4感染低表達癌細胞和細胞遷移侵襲試驗來進行研究，作出如下報告。

1 資料與方法

1.1 一般資料

子宮頸上皮永生化細胞系H8和子宮頸癌細胞系Siha（購于中國科學院上海細胞生物研究所）;細胞遷移侵襲試驗試劑盒和六孔板。Tim-4抗體（購于Santa Cruz）;Tim-4的慢病毒載體（上海吉凱基因）。

1.2 方法

構建含Tim-4慢病毒載體的子宮頸癌細胞系Siha。使用實時熒光定量PCR法檢測子宮頸上皮永生化細胞系H8和子宮頸癌細胞系Siha中Tim-4的表達水平，用Tim-4的慢病毒載體感染低表達Tim-4的Siha細胞系，觀察癌細胞感染后的Tim-4表達水平。使用細胞遷移侵襲試驗檢測Tim-4對子宮頸癌細胞系Siha的侵襲與遷移能力的影響。細胞遷移侵襲小室孔徑為8.0μm，使用稀釋液對上室預先處理，使Tim-4慢病毒載體和空載體轉染Siha細胞饑餓24h，再制備細胞懸液，在上室中加入200μL細胞懸液，再將FBS培養基放入下室。設置3個平行的觀察孔，24h后使用結晶紫染色，在顯微鏡下觀察，并拍照。使用蛋白質印跡法檢測子宮頸癌細胞系Siha中Tim-4和上皮細胞-間充質轉化蛋白的表達。

1.3 統計學方法

將數據納入SPSS 20.0軟件中分析，計量資料比較采用t檢驗，并以（±s）表示，P<0.05為差異顯著，有統計學意義。

2 結果

2.1 Tim-4mRNA表達水平對比

Siha細胞系中Tim-4mRNA表達水平為（1.63±0.03），H8細胞系中Tim-4mRNA表達水平為（0.97±0.06），P<0.05。見表1。

2.2 細胞遷移侵襲試驗結果對比

細胞遷移侵襲試驗結果顯示：Tim-4過表達的Siha細胞的穿模數為（102.14±5.14），空載體的穿模數為（56.34±10.21），P<0.05，見表2;蛋白質印跡法結果顯示Tim-4增強了EMT蛋白的表達。

3 討論

宮頸癌是婦科常見的惡性腫瘤，其病因可能與病毒感染、性行為、分娩次數等生物學因素和行為因素有關。造成宮頸癌患者主要的死亡原因是轉移和復發[4]。Tim基因家族是目前發現的與腫瘤、炎癥息息相關的基因家族，Tim-4作為主要的家庭成員之一，在抗原呈遞細胞以及巨噬細胞中都有表達。鼠系研究顯示，Tim-4在淋巴細胞中不表達，與Tim-1受體結合刺激T細胞增殖，調節機體的免疫作用[5]。

在Duo Y等[6]相關研究中，突變體Tim-4分子結構中的Arg-Gly-Asp（RGD）基序可以消除其促進肺癌細胞增殖的作用。Tim-4通過RGD基序與avβ3整合素相互作用，對肺癌細胞增殖起到促進作用。相關學者認為Tim-4的高表達與神經膠質瘤疾病的進展有著密切的聯系。早期，該研究小組的研究結果表明，Tim-4在宮頸癌組織中的表達相比較鄰近組織較高，而Tim-4高表達組的存活率與Tim-4低表達組相比則低得多。提示Tim-4能夠在宮頸癌的轉移以及復發中起到重要的作用。其在腫瘤轉移中的確切分子機制目前還未予以明確。在相關研究中表明。對患者進行了檢測Tim-4 mRNA，以體現其在宮頸癌細胞中的表達水平。結果表現為Tim-4在宮頸癌細胞系中表達相對較高。用Tim-4慢病毒感染表達量較低的Siha細胞系，進一步實驗發現過表達Tim-4可顯著增強子宮頸癌細胞系Siha的侵襲與轉移能力。深入研究表明，Tim-4的高表達能夠對宮頸癌細胞Siha的侵襲和轉移能力予以顯著提高。在Jie J等[7]研究中得知，Tim-4轉染后Siha細胞中基質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9和神經鈣黏附蛋白的表達明顯高于正常組，但E-鈣黏蛋白的表達則會出現降低。結果證明，Tim-4能夠后對質金屬蛋白酶-2、基質金屬蛋白酶-9和神經鈣黏附蛋白的表達予以增強，且對E-鈣黏蛋白的表達予以降低。表明Tim-4可經對Siha細胞EMT予以促進，提高腫瘤細胞的遷移和侵襲。腫瘤轉移的機制主要涉及原發灶向周圍基質和細胞外基質（ECM）的局部浸潤，且經過血液/淋巴管轉移至遠處的器官以及組織。此過程主要與上皮細胞-間充質轉化及其主要參與分子E-鈣粘蛋白和N-鈣粘蛋白有關。在上皮細胞-間充質轉化過程中，上皮癌細胞失去E-鈣粘蛋白而獲得神經鈣黏附蛋白，因此對上皮組織中細胞間連接予以破壞，低于腫瘤細胞的遷移以及侵襲能力予以提高。

有研究發現，Tim-4能夠通過調控巨噬細胞來對抗炎性疾病，而且在NSCLC（非小細胞肺癌）中的表達遠高于機體正常組織，且與肺癌的發展呈負相關，可以認為Tim-4能夠促進癌細胞的生長和增殖。

本次研究為分析Tim-4促進子宮頸癌細胞侵襲與遷移及其相關機制進行了相關實驗，結果顯示：Siha細胞系中Tim-4mRNA表達水平（1.63±0.03）>H8細胞系（0.97±0.06），P<0.05;Tim-4過表達的Siha細胞的穿模數為（102.14±5.14）>空載體（56.34±10.21），P<0.05;蛋白質印跡法結果顯示Tim-4增強了EMT蛋白的表達。在相關研究中得知，Tim-4可以增強MMP2、MMP9、N-cadherin的表達，并下調E-cadherin的表達，提示Tim-4可能通過促進Siha細胞EMT，促使腫瘤細胞遷移和侵襲能力增強。腫瘤的轉移機制主要涉及原發灶局部浸潤到在檢測子宮頸癌細胞中的Tim-4mRNA的表達水平時有高表達結果，提示過表達Tim-4可以增強子宮頸癌細胞系Siha的侵襲和轉移能力，將轉移與侵襲過程準確呈現。

綜上所述，Tim-4能夠促進子宮頸癌細胞侵襲與遷移能力，其機制為Tim-4促進了癌細胞中的上皮細胞-間充質轉化（EMT）。

參考文獻

[1] 姜杰，楊明浩，姜召玲，等.Tim-4促進子宮頸癌細胞SiHa侵襲與遷移及其可能機制[J].中國腫瘤生物治療雜志，2018，25（03）：270-274.

[2] 王速捷，崔敏，黎媛媛，等.Tim-4在宮頸癌患者中的表達及與疾病預后的相關性[J].中國婦幼保健，2019，34（15）：3413-3415.

[3] 李素芬，王唯斯，孫美濤，等.MTERF2在人子宮頸癌細胞株中的表達及對細胞增殖、遷移和侵襲的影響[J].生物技術通訊，2019，30（04）：464-472.

[4] 郭新穎，郭華峰.MYB基因沉默抑制子宮頸癌細胞侵襲、遷移及其作用機制探討[J].現代腫瘤醫學，2019，27（07）：1128-1131.

[5] Liu W，Bai F，Wang H，et al.Tim-4 Inhibits NLRP3 Inflammasome via the LKB1/AMPKαPathway in Macrophages[J].Journal of immunology（Baltimore，Md.：1950），2019，203（04）：1578-1579.

[6] Duo Y，Tao M，Jiang M.MicroRNA-454-3p inhibits cervical cancer cell invasion and migration by targeting c-Met[J].Experimental & Therapeutic Medicine，2018，15（03）：2301-2306.

[7] Jie J，Mingghao Y，Zhaoling J，et al.Effect of Tim-4 on invasion and migration of SiHa cervical cancer cell and its underlying mechanism[J].Chinese Journal of Cancer Biotherapy，2018，65（21）：127-138.