忽地笑不同器官RNA提取方法比較研究

樊青玲 周日寶 劉湘丹

摘要 [目的]建立忽地笑不同器官總RNA最佳提取方法。[方法]以忽地笑鱗莖、葉、花葶和花器官為材料，分別用普通試劑盒法、多糖多酚試劑盒法、Trizol法、SDS法和CTAB法進行不同器官總RNA提取方法比較。[結果]忽地笑不同器官最佳RNA提取方法不同，僅Trizol法能提取出鱗莖中RNA，普通試劑盒法和CTAB法均能提取出葉和花器官高質量RNA，多糖多酚試劑盒法和CTAB法能提取出花葶高質量RNA。[結論]普通試劑盒法是忽地笑葉和花的最快速、最簡便的提取方法;多糖多酚試劑盒法是提取花葶的最佳提取方法;CTAB法能有效去除多糖、多酚，適合忽地笑葉、花葶和花中總RNA提取;試劑盒法和CTAB法均能提取高質量RNA，滿足RT-PCR及后續試驗的要求。

關鍵詞 忽地笑;不同器官;RNA提取方法;RT-PCR

中圖分類號 Q943 ?文獻標識碼 A

文章編號 0517-6611（2020）18-0169-04

Abstract [Objective]To establish the best extraction method of total RNA from different organs of Lycoris aurea. [Methods]The methods of extraction of total RNA from bulb，leaf，calyx and flower different organs were compared by means of common reagent box method， polysaccharide polyphenol reagent box method， Trizol method， SDS method and CTAB method. [Result]The best RNA extraction method for different organs was different. Only Trizol method can extract RNA from bulbs， and both normal reagent box method and CTAB method could extract highquality RNA from leaves and flower organs. Polysaccharide polyphenol reagent boxed method and CTAB method could extract highquality RNA from calyx. [Conclusion]The common reagent box method is the fastest and simplest method for extraction of Lycoris aurea leaves and flowers. The polysaccharide polyphenol reagent box method is the best method for extraction of calyx. The CTAB method can effectively remove polysaccharides and polyphenols， which is suitable for the extraction of total RNA in Lycoris aurea leaves， calyx and flowers. The reagent box method and CTAB method can extract highquality RNA to meet the requirements of RTPCR and subsequent tests.

Key words Lycoris aurea Herb;Different organs;Extraction method of RNA;RTPCR

忽地笑（Lycoris aurea Herb），又名黃花石蒜，為石蒜科（Amaryllidaceae）石蒜屬（Lycoris）多年生草本植物[1]。忽地笑中富含生物堿、多糖和黃酮類化合物等[2]，其生物堿加蘭他敏是治療阿爾茨海默氏病（AD）的首選藥物之一。現階段加蘭他敏的生產來源主要是從石蒜類植物中提取得來，由于加蘭他敏結構復雜，植物中加蘭他敏的含量極低，同時人工合成步驟復雜且收率低，很難實現商業化生產[3-4]，因此，運用先進的分子生物學手段，研究加蘭他敏生物合成途徑，探究克隆控制加蘭他敏合成的關鍵酶（如兒茶酚氧位甲基轉移酶COMT），是一條行之有效的方法。

目前，忽地笑分子生物方面的研究主要集中在忽地笑加蘭他敏生物合成代謝途徑中相關基因克隆方面[5-7]和用ISSR法對忽地笑進行分子鑒別[8]，唐金鳳等[9]對黃花石蒜花蕊和花葶中總RNA提取方法進行了研究，但未對不同器官不同方法進行詳細研究。劉湘丹等[10]進行了人工栽培黃花石蒜不同器官中加蘭他敏含量測定，結果顯示加蘭他敏含量從高到低依次為花、根、花葶、鱗莖。該研究用5種方法對忽地笑不同器官RNA提取方法進行比較，篩選出了提取鱗莖、葉、花葶和花中高質量RNA的方法，為克隆忽地笑中合成加蘭他敏關鍵酶，并進行忽地笑不同器官中COMT酶的表達量與加蘭他敏含量間相關性研究提供前期試驗基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 試材。該試驗材料原植株引種于衡山，現引種栽培在湖南中醫藥大學藥用植物園，經周日寶教授鑒定為石蒜科石蒜屬忽地笑。采摘不同器官于液氮冷卻后，迅速置于-80 ℃冰箱保存備用。

1.1.2 試劑。

普通試劑盒（TIANGEN）;多糖多酚植物總RNA提取試劑盒（BioFlus）;Trizol提取液（Invitrogen公司）;瓊脂糖（上海生工）;β-巰基乙醇;RNA酶清除劑（DEPC）（北京索萊寶科技有限公司）; Revert Aid First Strand cDNA SynthesisKit逆轉錄試劑盒;DW2000 DNA Marker （康為世紀生物科技有限公司）;6×superstain Loading Buffer（康為世紀生物科技有限公司）;引物（上海生工）;2×Taq PCR MasterMix （康為世紀生物科技有限公司）。其他試劑均為分析純。

1.1.3 儀器。

美的微波爐（廣東美的廚房電器制造有限公司）;高速冷凍離心機（Thermo Fisher scientific公司）;THA-3560C高壓滅菌鍋（造鑫企業有限公司）;JY04-3C凝膠成像系統（北京君意東方電泳設備有限公司）;JY系列水平電泳槽（北京君意東方電泳設備有限公司）;Nano-200超微量核酸分析儀（杭州奧盛儀器有限公司）;ME204E電子分析天平（托利多儀器有限公司）;JY-96G PCR擴增儀（北京君意東方電泳設備有限公司）;微量移液槍（德國eppendorf 公司）。

1.2 試驗方法

1.2.1 總RNA提取方法。

1.2.1.1 普通試劑盒法。液氮研磨忽地笑不同器官樣品粉末各約0.1 g，根據北京天根總RNA提取劑盒法說明書進行操作，所得RNA提取液50 μL，-80 ℃保存備用。

1.2.1.2 多糖多酚試劑盒法。取液氮研磨的樣品粉末約0.1 g，根據Biospin多糖多酚植物總RNA提取試劑盒說明書進行操作，所得RNA提取液50 μL，-80 ℃保存備用。

1.2.1.3 Trizol提取法。取液氮研磨的樣品粉末約0.1 g，按Trizol使用說明書進行操作，所得RNA提取液50 μL，-80 ℃保存備用。

1.2.1.4 SDS提取法。參照王暑輝等[11]的操作步驟提取RNA。具體操作步驟如下：取液氮研磨的樣品粉末約0.1 g于加有600 μL SDS提取液[ 2% SDS、2% PVP、1.0 mol/L Tris-HCl，（pH=8.0）、0.25 mol/L EDTA]和40 μL β-巰基乙醇的1.5 mL離心管中，漩渦混勻;加入150 μL無水乙醇和150 μL 3 mol/L KAc，混勻; 12 000 r/min 4 ℃離心15 min;取上清液，加入250 μL水飽和酚和250 μL氯仿，混勻，冰上放置10 min;12 000 r/min 4 ℃離心15 min;取上清液，加入等體積氯仿，混勻，冰上放置10 min;12 000 r/min 4 ℃離心15 min;取上清液，加入等體積異丙醇，混勻，冰上放置10 min;12 000 r/min 4 ℃離心15 min;棄上清，加入1 ?mL 75%乙醇，溫和洗滌沉淀;12 000 r/min 4 ℃離心15 min;棄上清，干燥，用50 μL DEPC水溶解RNA，-80 ℃保存備用。

1.2.1.5 CTAB提取法。參照陳欣等[12]的操作步驟提取RNA。具體操作步驟如下：取液氮研磨的樣品粉末約0.1 g于加有600 μL CTAB提取液[ 2% CTAB、2%PVP、0.1 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）、0.025 mol/L EDTA、2 mol/L NaCl] 和15 μL β-巰基乙醇的1.5 mL離心管中，漩渦混勻，65 ℃水浴10 min;加入等體積的氯仿/異戊醇（體積比24∶1），渦旋混勻，12 000 r/min 4 ℃離心10 min;取上清液至新的離心管中，加入1/3的8 mol/L LiCl，4 ℃過夜，12 000 r/min 4 ℃離心10 min;棄上清，加75%乙醇500 μL洗滌沉淀;加500 μL SSTE液[0.5%SDS、1 mol/L NaCl、0.01 mol/L Tris-HCl（pH=8.0）、0.001 mol/L EDTA]、等體積苯酚/氯仿/異戊醇（體積比25∶24∶1）和氯仿/異戊醇（體積比24∶1）各抽提一次;加2倍體積無水乙醇，-20 ℃放置2 h，12 000 r/min 4 ℃離心20 min;沉淀用75%乙醇洗滌2次，自然晾干，用50 μL DEPC水溶解RNA，-80 ℃保存備用。

1.2.2 總RNA質量檢測。

1.2.2.1 純度和濃度測定。

分別取各總RNA樣品2 μL，用超微量核酸分析儀測定純度和濃度。

1.2.2.2 完整性檢測。

分別取5 μL RNA樣品，加1 μL 6×DNA Loading Buffer，用1.5%的瓊脂糖凝膠150 V電泳30 min，電泳結果用凝膠成像系統觀察并拍照記錄。

1.2.2.3 RT-PCR檢測。

為了進一步驗證不同方法提取的不同器官總RNA樣品純度和完整性是否符合分子克隆要求，該研究進行了RT-PCR試驗研究。

按Revert Aid First Strand cDNA SynthesisKit逆轉錄試劑盒說明書進行操作，將總RNA逆轉錄成第一鏈cDNA。從NCBI中搜索石蒜屬植物COMT基因的EST序列（CN451800、CN452615、CN452616、CN452617、CN452618、CN452619、CN453880），根據以上序列用Primer 5.0軟件設計RT-PCR簡并引物（正向引物：5′-GACAGACGAGGAGTGCGAGCAGATA-3′;反向引物：5′-ATGGCAAACTCTTACATTGGATGGT-3′）。以第一鏈cDNA為模板，構建25 μL擴增體系：ddH2O 9.5 μL，2×Taq PCR MasterMix 12.5 μL，cDNA 1 μL，正向引物1 μL，反向引物1 μL。PCR擴增程序為：94 ℃ 預變性2 min;94 ?℃變性30 s，60 ℃復性30 s，72 ℃延伸1 min，循環34次;72 ℃延伸10 min;最后于4 ?℃保溫。擴增產物在1.5%的非變性瓊脂糖凝膠上150 V電泳30 min，檢測目的條帶。

2 結果與分析

2.1 總RNA純度檢測

忽地笑不同器官不同方法所提取的總RNA 純度檢測結果見表1。OD260/280用于評估蛋白質污染，宜在1.8～2.0，小于1.8，可能有蛋白質污染，大于2.0，RNA降解。OD260/230用于評估有機殘留，宜大于2.0，若小于2.0，說明裂解液中有異硫氰酸胍和β-巰基乙醇殘留。由純度測定結果（表1）可知， 5種方法提取的鱗莖總RNA的OD260/230都小于2.0，除了Trizol法其他4種方法的OD260/280都小于1.8，說明有蛋白質污染，異硫氰酸胍和β-巰基乙醇殘留;普通試劑盒法、多糖多酚試劑盒法和CTAB法提取的葉總RNA其OD260/230 和OD260/280基本符合要求;多糖多酚試劑盒法和CTAB法提取的花葶總RNA其OD260/230 大于2.0，OD260/280 在1.8～2.0;普通試劑盒法、多糖多酚試劑盒法和CTAB法提取花總RNA其OD260/230 和OD260/280基本符合要求。分析不同器官總RNA提取純度發現，多糖多酚試劑盒法和CTAB法能很好地去除忽地笑葉、花葶和花中多糖、蛋白質，并且異硫氰酸胍和β-巰基乙醇基本上無殘留。

2.2 完整性檢測

不同器官不同方法提取的RNA在1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測結果見圖1。高質量的RNA一般是28S和18S條帶明亮、清晰，28S條帶亮度為18S的1.5～2.0倍，并且無彌散、無降解。從圖1可以看出，鱗莖樣品僅Trizol法提取的RNA電泳結果有28S和18S條帶，且2條帶亮度差不多，說明RNA有一定的降解;葉樣品普通試劑盒法和CTAB法提取的總RNA其28S條帶亮度約為18S的2倍，但多糖多酚試劑盒法、Trizol法和SDS法提取的RNA均有明顯的降解和DNA污染情況;花葶樣品多糖多酚試劑盒法和CTAB法提取的總RNA其28S條帶亮度為18S的約2倍，SDS法提取的總RNA有明顯的降解和污染;花樣品普通試劑盒法和CTAB法提取的總RNA其28S條帶亮度為18S的1.5～2.0倍，多糖多酚試劑盒法提取的總RNA有明顯的DNA污染，Trizol法和SDS法提取的總RNA有明顯的降解。

2.3 RT-PCR檢測

為了進一步驗證用Trizol法提取鱗莖總RNA、普通試劑盒法和CTAB法分別提取葉總RNA、多糖多酚試劑盒法和CTAB法分別提取花葶總RNA、普通試劑盒法和CTAB法分別提取花總RNA能否滿足后續試驗，將以上方法提取的RNA逆轉錄，用簡并引物進行RT-PCR驗證，電泳結果見圖2。電泳結果顯示以上方法均能擴增出350 bp的目的條帶。

3 結論與討論

目前，植物中RNA提取的方法主要有CTAB法、SDS法、Trizol法[11，13]、試劑盒法[14] 、熱酚法[15]、異硫氰酸胍法[12，16]等，對不同植物RNA提取方法研究較多，但不同植物不同器官有不同的最佳提取方法。筆者通過對忽地笑鱗莖、葉、花葶和花中總RNA不同提取方法比較研究，發現僅Trizol法能提取出鱗莖中RNA，普通試劑盒法和CTAB法均能提取出葉和花器官高質量RNA，多糖多酚試劑盒法和CTAB法能提取出花葶高質量RNA，均能滿足后續試驗，證實同一種植物不同器官RNA最適提取方法有所不同。

用5種方法提取忽地笑鱗莖總RNA的OD260/230 和OD260/280基本上都不在適宜的范圍內，其可能是因鱗莖中含有大量多糖與RNA一起被沉淀有關[17-18]，電泳顯示僅Trizol法有條帶， RT-PCR檢測出目的條帶，但獲得鱗莖中高質量RNA的方法還需改進。葉和花較好的提取方法都為普通試劑盒法和CTAB法，2種方法相比，普通試劑盒法提取僅需1～2 h，且RNA質量較高，而CTAB法提取時間較長，提取期間避免不了對RNA的污染和影響，從電泳圖可知有明顯的蛋白質污染和DNA污染。花葶較好的提取方法為多糖多酚試劑盒法和CTAB法，由于CTAB法存在眾多上述缺點，最佳提取方法為多糖多酚試劑盒法。

縱觀忽地笑RNA提取方法，試劑盒法是提取忽地笑不同器官RNA的最快速、最簡便的方法，且多糖多酚試劑盒法更能針對性地有效去除多糖和酚類化合物。Trizol法不能有效去除多糖和蛋白質，RNA存在明顯的降解，不能提取完整的RNA，說明此方法對忽地笑不合適。SDS法提取不同器官時都存在RNA嚴重降解和污染問題，其可能與操作時間較長有關。CTAB法以CTAB為變性劑，同時加入PVP和β-巰基乙醇共同作用變性蛋白和抑止RNase的活性，使用無水乙醇和異丙醇沉淀雜蛋白和總核酸，能很好地去除多糖、多酚，分離出較好的RNA，但CTAB 法操作繁瑣，需要多次沉淀RNA，操作時間較長，容易造成污染。所以，找到最佳RNA提取方法、提取高質量RNA是后續試驗成敗的關鍵。

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